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浅析基因工程技术的应用现状.doc

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浅析基因工程技术的应用现状.doc

浅析基因工程技术的应用现状动物医学专业任课教师指导教师姓名摘要基因工程作为一门理论性与实践性较强的学科,其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域,成为生命科学的一门核心技术。基因工程包含许多独特的实验方法和技术,不仅内容丰富,涉及面广,实用性也强。基因工程是通过DNA重组技术,获得具有特殊生物遗传性状和功能的遗传工具生物体,基因工程技术广泛应用于农业、医学、食品工业等。本文就基因工程的应用现状综合阐述。关键词基因工程应用现状0.前言基因工程技术是一项极为复杂的高新生物技术,它利用现代遗传学与分子生物学的理论和方法,按照人类所需,用DNA重组技术对生物基因组的结构和组成进行人为修饰或改造,从而改变生物的结构和功能,使之有效表达出人类所需要的蛋白质或人类有益的生物性状1。基因工程从诞生至今,仅有30年的历史,然而,无论是在基础理论研究领域,还是在生产实际应用方面,都已取得了惊人的成绩。首先,基因工程给生命科学自身的研究带来了深刻的变化。目前科学家已完成了多种细胞器的基因组全序列测定工作。其次,基因工程具有广泛的应用价值,能为工农业生产、医药卫生、环境保护开辟新途径。1.基因工程1.1概念基因工程又称DNA重组技术、基因重组技术,是20世纪70年代初兴起的技术科学,是用人工的方法将目的基因与载体进行DNA重组,将DNA重组体送入受体细胞,使它在受体细胞内复制、转录、翻译,获得目的基因的表达产物。这种跨越天然物种屏障,把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力,是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。1.2基因工程研究内容1从复杂的生物有机体基因组中,经过酶切消化或PCR扩增等步骤,分离出带有目的基因的DNA片段。2在体外,将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上,形成重组DNA分子。3重组DNA分子转移到适当的受体细胞,并与之一起增殖。4从大量的细胞繁殖群体中,筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。5从这些筛选出来受体细胞克隆,提取出已经得到扩增的目的基因,供进一步分析研究使用。6将目的基因克隆到表达载体上,导入寄主细胞,使之在新的遗传背景下实现功能表达,产生出人类所需要的物质。2.基因工程的广泛应用2.1在农业上的应用2.1.1抗除草剂的植物基因工程资料表明,每年杂草造成的经济损失占农作物总产值的1020左右尽管除草剂的使用,对大规模机械化耕作,减少劳力开支和提高量有极为重要的作用,但一般除草剂的选择性较差,即除了杀草以外,还会将作物杀死。现在利用生物技术,将能抵抗除草剂的基因转移到植物中,获得抗除草剂的植物,如美国的孟山都公司将除草剂草甘磷的靶酶EPSPS的cDNA克隆转入油菜2,目前,已获得的抗除草剂作物有大豆、棉花、玉米、水稻和甜菜等20多种。2.1.2抗虫的植物基因工程生物防治害虫的工作已经开展多年,主要是利用苏云金杆菌中的毒蛋白结晶蛋白对害虫有毒害作用,使用这些杆菌来控制害虫。现在,人们可以通过克隆这些毒蛋白的基因Bt基因并把这些基因转移到植物细胞中,从而获得能抗虫的转基因植物。目前,Bt基因已被转入烟草、番茄、马铃薯、水稻、玉米及棉花等多种植物中。1996年转Bt基因棉花在美国种植66万hm2经中国农科院棉花所引进在华北试种两年,在多点表现突出,在完全不喷杀虫剂的情况下,单产仍然高于喷撒23次杀虫剂的中国推广棉花3,显示出了控制棉铃虫的极好前景。2.1.3动物转基因育种动物基因工程研究主要集中在改良家畜、家禽的经济性状和通过转基因动物进行药物或蛋白质的生产等方面,目前已取得了显著的成就,先后培育出转基因猪、羊、牛和鱼等,另一种转基因猪是带有人体基因的猪,这种转基因猪客望能解决人体移植动物器官的遗体排斥问题。随着动物基因工程技术的逐渐成熟和转人体血红蛋白的基因猪、转人体血清蛋白的基因山羊等的问世,不仅能生产出大量人类所需的血红蛋白、白蛋白等药物而且为动物育种开辟了一条全新的途径。2.2在医学上的应用2.2.1基因工程药物利用基因工程技术开发新型治疗药物是当前最活跃和发展最快的领域。自1982年世界第一个基因工程药物重组胰岛素投放市场以来,基因工程药物就成为制药行业的一支奇兵,每年平均有34个新药或疫苗问世,开发成功的约50个药品,诸如人胰岛素、忍尿激酶、人生长激素、干扰素、激活剂、乙肝疫苗等广泛应用于治疗癌症、肝炎、发育不良、糖尿病和一些遗传病上,在很多领域特别是疑难病症上,起到了传统化学药物难以达到的作用4,5,6。为治愈癌症正在研制的用单克隆抗体制成的生物导弹,就是按照人类的设计,把生物导弹发射出去,精确的命中癌细胞,并炸死癌细胞,而不伤害健康的细胞,比如专门用于肿瘤的肿瘤基因导弹等。可见,生物工程药物将成为21世纪药业的支柱。而脱氧核糖核酸或者基因疫苗的问世,变革了机体的免疫方式。如今,人们翘首关注困扰人类的艾滋病病毒疫苗的早日问世。尽管目前诱变育种技术仍是改良微生物工业生产菌种的主要手段,但是基因工程技术在改良工业生产菌种方面已有成功的报道。最常见的是将控制药物合成关键步骤的酶基因克隆,通过适当的载体转移到原生产菌中,以使控制限速步骤的酶水平,从而提高产量。Malmberg等7构建了一种带有编码赖氨酸ε氨基转移酶基因lysineεaminotransterase,LAT这种控制Streptomycesclavuligerus生物合成头霉素C的限速步骤的关键酶的基因lat的高拷贝质粒,并转入这种头霉素产生菌,使LAT提高活力提高了4倍,在2L发酵罐中产生头霉素的能力是原来的2倍,重组菌胞外LAT产物α氨基己二酸的积累量也比原受体菌高。伊维菌素ivermectins是一个市场很大的抗虫抗生素,其前体阿弗米丁avermectins的产生菌种的发酵液中有8个以上的组分,其中只有B1a组分才是制备伊维菌素的原料。Ikeda等8经过近十年的努力,已将阿弗米丁的生物合成基因簇全部搞清,并经过诱变与DNA重组,获得了仅产阿弗米丁B2a单一组分和B1a、B2a组份的重组工程菌,这不仅大大提高了阿弗米丁有效组分的发酵效价,且给提取、精制、半合成等后处理工序带来了很大的便利。可以预见,随着对各种工业生产的微生物药物生物合成途径的深入了解以及基因重组技术的不断进展,应用基因工程方法定向构建高产菌株的成功实例将越来越多。在抗生素发酵过程中供氧往往是一个限制因素,充足的氧气供给是药物工业发酵稳定和提高产量,降低成本的关键。传统的解决方法如增加通气量等对设备要求高,能量消耗大。20世70年代末在专性好氧菌透明颤Vitreoscilla中发现了血红蛋白VHb,它能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶上。于是人们想到了将其基因Vgb克隆到其它微生物中,以促进微生物在低氧条件下生长。1988年Khosla等9从Vitreoscilla中分离出Vgb基因并将之转入大肠杆菌Ecoli,提高了大肠杆菌在溶氧量低于5时对氧的利用率。目前已用克隆表达VHb的方法提高了放线紫红素、头孢霉素C、红霉素等产生菌及青霉素酰化酶基因工程菌的产量10。血红蛋白基因工程的研究和应用,必将对抗生素工业和其它重组药物发酵工业的节能等带来美好的前景。作为半合成头孢菌素类抗生素重要原料的7氨基头孢烷酸(7ACA,目前国内外仍以化学裂解头孢菌素C的工艺路线为主。国内外已报道可用经由GL7ACA的二步法化学/酶法或二步酶法来生产7ACA,与化学裂解法相比不仅收率提高,且能大大减少环境污染,简化生产工艺。但二步法中关键的GL7ACA酰化酶在假单胞菌中表达量低而且分离纯化困难,限制了这种方法的应用。通过将GL7ACA酰化酶基因转入大肠杆菌中表达恰好可以解决这一问题11。最近又报道可将编码2个酶的基因直接转入头孢菌素C的生产菌种中,使其在发酵时直接产生7ACA。调节基因在药物的生物合成中也起着重要作用,增加调节基因的基因量能够大幅提高药物产量。Hopwood等将放线紫红素生物合成的一个调节基因actⅡ导入原产生菌,尽管基因的拷贝数仅增加了2倍,放线紫红素的产量却增加了3040倍。某些抗生素生产菌的产量不高,是由于其自身对该抗生素的抗性不高。因此,利用高拷贝质粒的基因量效应,增加菌种对自身产生的抗生素的抗性,可能增加抗生素的产量。例如,将氨基糖苷6乙酰转移酶基因导入卡那霉素和新霉素产生菌,由于提高了对氨糖类抗生素的抗性,产量提高了26倍2.2.2基因治疗基因治疗是指由于某种基因缺陷引起的遗传病通过转基因技术而得到纠正。临床实践已经表明基因治病已经变革了整个医学的预防和治疗领域。比如白痴病,用健康的基因更换或者矫正患者的有缺损的基因,就有可能根治这种疾病。现在已知的人类遗传病约有4000种,包括单基因缺陷和多基因的综合症。运用基因工程技术或基因打靶的手段,将病毒的基因杀灭,插入矫正基因,得以治疗、校正和预防遗传疾病的目的。目前,基因治疗已扩大到肿瘤、心血管系统疾病、神经系统疾病等的治疗12。人类也已成功实现了肾、心、肝、胰、肺等器官的移植,也有双器官和多器官的联合移植。基因治疗有两种途径一是体细胞的基因治疗,一是生殖细胞的基因治疗。由于生殖细胞的基因治疗操作技术异常复杂,又涉及伦理缓行之理充足,故尚无人涉足13。基因工程是20世纪生命科学中最伟大的成绩,开辟了生命科学的新纪元。经过几十年的发展,基因工程技术已成为一个巨大的朝阳产业,它可以超越动物、植物、微生物之间的界限,创造出新的生物类型。基因工程不仅在医学上应用广泛,而且也广泛应用在工业、农业、冶金、环保、资源、能源、畜牧渔业等领域,为人类的丰衣足食和健康长寿提供了持续的实用价值很高的产品,发展前景极为广阔。参考文献1陈渝军,林晶.基因工程技术在医药卫生领域的应用及发展.药品评价,2005,22144145.2童克中.基因及其表达.北京科学出版社,2001.3李尉民,乐宁,夏红民.转基因生物及其产品的风险与管理.生物技术通报.200044144.4朱宝泉.基因工程技术在医学工业中的应用及进展J.中国医药工业志.1997.2825658.5方鹏.基因工程应用简述J.辽宁师专学报.2004.622930.6周黎,柯传奎.基因工程药物研究现状与对策J.生命科学仪器2004.122.7MalmbergLH,HuWS,ShermanDHJournalofBacteriology,1993,17511691669248HaruoIkeda,SatoshiOmuraJournalofAntibiotics,1995,4875495629ChaitanKhosla,JamesEBNature,1988,33163363510郭宏秋,杨胜利微生物学通报,1996,23422723011周煜,刘涤,胡之璧药物生物技术,2000,7425125312路正兵,夏颖.基因工程在疾病防治及药物研制上的应用J.安徽预防医学杂志.2000.65398400.13王俊杰21世纪基因工程在肿瘤防治中的应用J2000.666267.分子生物学谈基因工程技术如何应用于植物摘要通过基因工程改良品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。尽管科学家们对转基因植物的争论仍在继续,但可以肯定的是,转基因植物作为一项新兴的生物技术的产物,在解决日益膨胀的地球人吃饭问题和在解决长期困惑人类发展的资源短缺、环境恶化、经济衰退三大难题中起着越来越重要的作用。本文综述了基因工程技术在植物中的应用,就转基因植物的技术、发展、安全性和发展前景作了探讨。关键词基因工程技术转基因植物安全性发展前景所谓转基因植物是指利用基因工程技术,在离体条件下对不同生物的DNA进行加工,并按照人们的意愿和适当的载体重新组合,再将重组DNA转入生物体或细胞内,并使其在生物体内或细胞内表达的植物。自1983年首次获得转基因植物以来,转基因技术发展十分迅速,成功的转基因植物已达60多种,在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例。1植物的转基因技术由于植物的体细胞具有全能性,即单个的细胞经过合适培养后可以生成完整的植株。将分离能够编码所需产物的DNA片段克隆到适当的载体DNA中形成重组DNA,利用细菌繁殖扩增重组DNA并将重组DNA中的目的基因导入所需的培育的植物细胞中,筛选出所需要的细胞,通过细胞的全能性将转基因植株大规模种植。其中外源基因导入植物细胞的方法可分为DNA直接转化和以载体为媒介的基因转化。基因的直接转移是通过物理化学法将外源基因转入受体植物细胞的技术。常用的方法有化学刺激法、脂质体法、显微注射法和基因枪法等。其原理是利用物理化学方法暂时改变膜通透性,使DNA进入细胞,并最终整合到植物基因组中。以载体为媒介的基因转化即使通过农杆菌或植物病毒介导感染受体植物将外源基因转入植物细胞的技术。目前,载体法主要包括土壤农杆菌Ti质粒、Ri质粒及植物DNA病毒等介导的遗传转化法。2转基因植物的筛选与检测通过转基因的方法将目的基因转入目的植物的细胞后,转化细胞与非转化细胞相比都只占少数,两者存在竞争,而转化细胞的竞争力通常比非转化细胞弱,因此必须对转化细胞进行筛选和检测。在构建重组DNA时,人们已经引入了标记基因以对转化子选择和鉴定。报告基因由于其表达产物易于检测,已广泛用于转基因植物中。根据报告基因编码特点,大致分为两类抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因或发光基因。根据检测的不同阶段区分,有DNA检测法、RNA检测法及蛋白质检测法。DNA检测法只能检测到外源基因是否已经整合到植物基因组中,而RNA检测法得到的结果可判定外源基因是否转录,蛋白质检测法则可检测出外源基因是否翻译。3改进转基因的技术随着植物转基因技术的创立和发展,许多具有重要经济价值的农作物获得了转基因植株,植物转基因技术成为植物育种的一个重要手段,但仍有许多问题阻碍了转基因技术在生产上的广泛的应用。将外源DNA导入植物细胞后,只有外源DNA在宿主细胞及其子代细胞中稳定整合和有效的表达,才能培育出具有新的遗传性状的转基因植物。大量研究表明外源基因在转基因植物中有的能正常表达,有的表达量很低,甚至不表达,而且在不同的植株个体之间也存在着明显差异。所以提高转基因的表达,减少转基因的失活是转基因技术的一个重要内容。提高外源基因表达水平的措施有3.1农杆菌介导的遗传转化方法由于其产生的拷贝数相对较少,可以在一定程度上避免这个问题。3.2使用信号肽,每种植物蛋白质的作用空间位置都是不同的,蛋白质分子的定向运输需要特殊多肽信号的引导作用。3.3选择强启动子和诱导型启动子3.4使用强终止子常用的终止子时CaMV35S终止子和根瘤土壤杆菌TDNA的胭脂氨基酸合成酶基因的nos终止子。3.5消除甲基化的影响在载体上加上去甲基化功能的序列以防止甲基化。3.6使用植物偏爱的密码子3.7使用MAR序列3.8使用增强子3.9对外源基因进行修饰和改造3.10以叶绿体作为转化受体3.11使用一些病毒编码蛋白

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