流式细胞术在肿瘤学中的应用医学

流式细胞术在肿瘤学中的应用,内容,流式细胞仪概念、原理及应用 流式细胞术优势 流式细胞术在肿瘤学中的应用,流式细胞术（Flow Cytometry）是利用流式细胞仪检测细胞或其它颗粒性物质的物理、化学特性。同时利用荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术的发展,大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。,流式细胞术,流式细胞仪检测流程,流式细胞术优势（分析型） 高速测定细胞，大样本计数 检测稀有细胞 多参数分析,FC500 流式细胞仪,流式细胞术的应用,检测特性：大小、颗粒度 、细胞受体/分子、核酸 (DNA/RNA)、蛋白,肿瘤学中的应用,肿瘤免疫 肿瘤细胞周期和凋亡 肿瘤干细胞的研究 血液中循环肿瘤细胞的研究,肿瘤免疫学,天然免疫 中性粒细胞 嗜酸性细胞 嗜碱性细胞 单核细胞 / 巨噬细胞 树突细胞: mDC - pDC NK 细胞 NKT 细胞 T 淋巴细胞 CD5+ B 细胞,获得性免疫 B细胞 辅助性T细胞 Th1 Th2 细胞毒T细胞 调节性T细胞,淋巴细胞免疫分型 T细胞： CD3+ CD4+ (Th，Treg) CD8+ (Tc) B细胞： CD19+ NK细胞：CD3- CD56+,肿瘤细胞免疫特点,Th1Th2细胞因子分泌细胞测定,Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。 Th2细胞 ：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。,Th1/Th2漂移与肿瘤免疫,肿瘤可使Th1/Th2平衡向Th2偏移,而Th1/Th2偏移又会促进肿瘤的发展,故探讨Th1/Th2功能状况以判断肿瘤患者的免疫状态可为肿瘤生物治疗提供有效的理论依据。,CD4+CD25+调节性T细胞,调节性T细胞具有免疫抑制功能，在多种免疫性疾病中起重要的调节作用，成为近年来免疫学领域研究的重要内容。,许多研究表明：在实体肿瘤和血液恶性肿瘤患者中Treg数目增多。 在乳腺癌、卵巢癌、肺癌以及肝癌等多种实体肿瘤患者外周血和肿瘤局部微环境中,Treg比例增高,且数目与患者肿瘤进展程度和预后、生存率呈负相关。 血液恶性肿瘤患者中Treg数目呈肿瘤发展阶段相关性增长。但是,Treg增高的机制尚不清楚。 去除Treg或封闭其抑制功能，可以增强抗肿瘤免疫反应。,化疗作为一种重要的治疗肿瘤的方法,对肿瘤患者外周血中的Treg数目可产生一定影响。 化疗药物可能通过抑制肿瘤微环境中血管生成,促进Treg凋亡,从而起到有效控制肿瘤的作用。 但也有报道证明肿瘤患者接受化疗后,外周血中Treg数目增多。,化疗究竟对Treg会产生怎样的影响,目前尚无定论,有待于进一步研究。 因此,Treg在肿瘤治疗方面的应用成为研究的热点。如何清除或逆转Treg的抑制作用是肿瘤免疫治疗的一个关键问题。,树突状细胞 (DC) DC控制体内免疫和耐受的平衡 控制T,B 细胞对可溶性抗原的反应 影响产生免疫球蛋白的分类 DC 亚群 分为MDC 和PDC MDC诱导免疫应答 PDC诱导免疫耐受,树突状细胞流式分析,阴性表达抗原设门 Lin (CD3,14,19,20,56)/HLADR组合 DC: Lin-/HLADR+ DC亚群分析 骨髓DC: CD11c+ 外周血DC: CD123+ (IL3Ra) 阳性表达抗原设门 CD85k (ILT3) 阳性设门 仅在单核巨噬细胞及DC细胞表达 比HLADR表达更具特异性 避免阴性设门 Differentiation of DC subsets: 外周血DC: CD123+ (IL3Ra) 骨髓DC: CD33+,ILT3-PE,ILT3-PE,CD14+CD16-FITC,CD33-PC5,CD33-PC5,1,2,3,4,骨髓DC : CD14 CD16/ CD85K（ILT3）/CD33,ILT3-PE,ILT3-PE,CD14+CD16-FITC,CD123-PC5,CD123-PC5,外周血DC: CD14 CD16/ CD85K（ILT3） /CD123,生物免疫治疗 CIK细胞(cytokine-induced killer)是一群以CD3+T细胞为主的异质性细胞群体，包括CD3+CD56-、CD3-CD56+及CD3+CD56+三种亚群, 主要效应细胞为CD3+CD56+细胞。 CIK细胞来源于外周血中的CD4-CD8+及CD4-CD8-T细胞。因其同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤特点，是目前所知杀伤活性最强的一种免疫效应细胞。,CIK细胞治疗过程的评价,治疗前病人免疫状况评价,T亚群、NK、CIK、细胞因子,是否适合做、能否能培养、值得做CIK,采集MNC,MNC数目、纯度、 T亚群、NK、CIK数目及比例,是否达到培养要求、调节细胞数,MNC数目、 T亚群、NK、CIK数目及比例、CD3、CD8活化状况,培养,培养是否达标、回输时机,回输后,T亚群、NK、CIK、细胞因子,疗效评价、监测、下次治疗的时机,CIK治疗程序,FCM检测项目,意义,CIK治疗前患者的免疫功能评价,评价的项目 免疫功能六项：CD3、CD4、CD8、CD4/CD8、 NK、 CIK Th1/Th2细胞因子,FCM检测的方法 免疫功能六项 试剂：CD45/CD4/CD8/CD3、CD3/CD56/CD45 标本类型：外周抗凝血 评价的指标：CD3%、CD4%、CD8%、NK%、CIK%（也可以做绝对计数）,评价的意义 1、CIK治疗的适应症： 除外T细胞相关肿瘤、有可见包块 2、是否适合做 3、能否培养 4、值不值得做,肿瘤细胞免疫特点,采集物评价（培养体系）,评价的项目 MNC数目、纯度、 T亚群、NK、CIK数目及比例 FCM方法评价 评价的意义 是否达到培养要求、调节细胞数,培养中的监测,评价的项目 1. MNC数目、 T亚群、NK、CIK数目及比例、CD3、CD8活化状况 2. 培养体系中的细胞因子水平 3.CIK细胞质量：坏死、凋亡状况 评价方法：FCM 评价的意义：培养是否达标、回输时机,确定回输时间及培养物是否达到要求:,CIK细胞一般在7-9天 要求: CD3细胞大于90% CD8细胞大于60% CIK细胞 0.51 X 109个 时机选择: 基本达标，CD3+HLA-DR+细胞占CD3的50%左右，CD8+HLA-DR+细胞占CD8的50%左右。,回输后的监测,谢谢！,THANK YOU!,