克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用.ppt

克隆性基因重排在淋巴瘤诊断中的应用,分子和细胞遗传学异常,抗原受体基因的克隆性重排 与类型相关的染色体异常,简要原理 检测方法 应用和策略 注意事项,淋巴细胞表面受体,IG： IGH （14q32) IGL (2q12) (22q11) TCR: TCR 14q11 TCR 7q32 TCR 7p15 TCR 14q11.2,IG和TCR基因结构及重排过程,胚系,各区片段数多 重排的多样性 抗体多样性,淋巴细胞发育过程中基因重排顺序,IG: H重排: IgH/ 缺失 ： IgH/ TCR: ：TCR ：TCR ,淋巴瘤中基因重排形式 克隆性重排,不同的淋巴细胞 相同的重排形式 淋巴细胞单克隆性增生 淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标,克隆性重排的检测方法,Southern 杂交 PCR法,特异性探针： 胚系的特征性片段外 另一不同大小的片段,Southern 杂交,优点： 敏感性较高 可靠性高 缺点： DNA量多（10ug) 新鲜组织 操作复杂 时间长、成本高 放射性同位素 逐渐被PCR方法替代,PCR法,原理: VDJ重排 后相互靠拢，用适当的引物可扩增出重排片段,新鲜、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本， 不受DNA片段的影响，仅需要少量的DNA， 时间短，敏感性高， 是目前最常用的克隆性重排的检测方法。,引物的选择原则,引物位置：PCR产物长度10-15bp 引物本身的长度25bp 精确地将所有VDJ基因片段捡出 家族性引物或通用引物 不同的组合具有互补性，提高阳性率 引物数目和同源性之间平衡,该协作研究由47个研究所组成7个网络和一个病理panel。它由分子生物学、免疫学、血液学、病理学等领域的专家。 1998.6-2002.7， 12次国际性会议。 主要目的： （1）开发和标准化PCR实验操作和PCR引物 （2） 评价和应用该标准化方法,BMH4CT983936的欧洲BIOMED2 协作研究,设计了一套完整的引物和方法用于IG和TCR基因重排的克隆性分析，共有14管97对引物 IGH（A,B,C,D,E 5管） IGK（A，B 2管） IGL（1管） TCRB（A，B，C 3管） TCRG（A，B 2管） TCRD(1 管) Van Dongen JJM et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the Biomed-2 concerted action BMH4-C98-3936 Leukemia 2003;17:2257-2317,所有引物采用相同的扩增条件和检测方法，并具有很高的敏感性和特异性， 已被推荐为可疑淋巴组织增生性疾病克隆性分析的标准方法，试剂已商品化 http:/www.invivoscribe.com/,PCR产物分析方法,克隆性重排判断基本原则： 条带在期望的碱基大小范围内；一条或两条 带宽不超过1mm, 边缘整齐； 多克隆性： 无特异性条带，弥散带或梯状带,聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)-异源双链分析,+,-,2. 毛细管电泳基因扫描（genescan）,单克隆性细胞产生一个或两个尖的峰，多克隆为多个小峰，呈Gaussian分布。 （本课题组曾用两种方法分析180管皮肤淋巴瘤的TCR基因重排，两者的符合率为96.7%, 在TCRB用genescan方法稍敏感，在TCRD用PAGE更特异。）,对照的设立,阳性对照 阴性对照,内对照: 3个病例的内对照b-actin均为阳性,对照的设立,克隆性基因重排的应用,诊断与鉴别诊断 谱系确定 分期 克隆相关性判断,（1）形态和IHC不能得出肯定结论的淋巴组织增生性病变 胃肠道、肺、涎腺、甲状腺、眼眶等部位的MALT淋巴瘤 滤泡性淋巴瘤、皮肤淋巴瘤和T细胞淋巴瘤 形态不典型，缺乏特异性标记,CP2170, 66M, 胃黏膜活检 CP2171, 43F, 左腮腺肿块,明显的浆样分化细胞,CP2170 ： FR1 (+), FR2(+), FR3(+) 诊断： （胃）小B细胞淋巴瘤，倾向MALT边缘区B细胞淋巴瘤 CP2171： FR1 (+), FR2(+), FR3(-) 诊断：（左腮腺）符合MALT边缘区B细胞淋巴瘤,（2） 形态和免疫组化均可考虑为淋巴瘤 但部位少见或发病年龄不典型 基因重排克隆性分析可增加诊断的依据,54M, 舌跟部肿块， PTCL 1M, 左颈鸡蛋大肿块, PTCL? 17 F, 右颈部淋巴结 FL 38M, 左颈部淋巴结 AILT,17F, 右颈淋巴结肿大,- + - + - + - +,CD20,Bcl-2,3. 组织小或无法取得组织病变的诊断,深部肿块的穿刺或活检标本如胃镜标本 无明显肿块，仅表现为胸腹水 但要特别注意细胞的量,52M ， 左眼内吸取物 细胞涂片检查：见恶性肿瘤细胞，小圆细胞肿瘤，倾向淋巴瘤 基因重排：FR1(+), FR2(+), FR3(-),(4) 淋巴瘤谱系的判断 T or (富于T) B? T or NK/T? , T or -T ?,34M, 右面部肿胀5月，CD56-, TIA+, PE+, EBER+, TCRr (-), TCRb (-),内 1 2 12,TCR(-) TCR(-),CD56,EBER,(5） 比较两个淋巴瘤克隆性的相关性， 或区别复发和第二原发肿瘤。 组织细胞/树突细胞肉瘤- ALL, T淋母 ( 6） 外周血和骨髓累及情况,MRD理想的检测方法： 活检组织的PCR产物克隆， 对连接区进行测序， 再设计病人特异的引物做real-PCR进行MRD的评价,应用策略,采用所有引物组，工作量大，不实用，没有必要， 有交叉和重叠 合理的应用策略以最少的引物组最大可能地检测克隆性,Suspected B-cell Proliferations,Suspected Lymphoid Proliferations of unknown origin (B or T),Suspected T-cell Proliferations,TCR+ Proliferations or immature T-cell,IGH (VH-JH),IGK,Preferably with,No clonality but still suspected,IGH (DH-JH),Preferably with,IGL,Clonal (generally multiiple Clonal results),Clonal,No evidence of clonality,TCRB,Preferably with,TCRG,TCRG,TCRD,and,Results should be considered in the context of all available clinical, histological and immunophenotypic data,Van Krieken, et al. Leukemia 2007;21:201-206,Suspected B-cell Proliferations,Suspected Lymphoid Proliferations of unknown origin (B or T),Suspected T-cell Proliferations,IGHB+IGKA+B,Preferably with,No evidence 0f presence of clonal B/T population in the samele,IGHB+IGKA+B,IGHA+C+D,IGL+IGHE,TCRGA+B,TCRBA+B,TCRBA+B+C,TCRBc +TCRD,TCRBC+TCRD,TCR TCR,If not clonal,If not clonal,If not clonal,Liu et al. British J Haematol 2007;138：31-43,Lineage unknown,1. 克隆性不等于恶性： 有些良性病变有时也有克隆性重排 CD8+（有时CD4+) T 细胞增生症 良性单克隆性r球蛋白病 EBV阳性的淋巴细胞增生 （AILT) 自身免疫性疾病(Sjogren 综合症,风湿性关节炎) 免疫缺陷状态(先天性,移植后,HIV感染) 免疫调节异常疾病（Castleman 病） 皮肤异常病变（淋巴瘤样丘疹病，急性苔藓样糠疹）,结果的解释和注意事项,30例LyP病例TCR基因重排总体阳性率80% 20例CALCL病例TCR基因重排总体阳性率100%， 两组病例TCR基因重排阳性率无统计学差别（P0.05) 表明TCR基因重排在LyP和CALCL的鉴别中无应用价值。,必须结合临床病史,Ig和TCR基因重排不一定是谱系的标志： 某些T、B淋巴瘤有基因重排的交叉,T,B之间：不成熟的T或B相对频繁 TCRab, TCRrd之间,少量淋巴细胞 小标本或高负荷B细胞淋巴瘤中有少量反应性T细胞 EBV或CMV感染 免疫抑制患者 淋巴结或外周血中TCR的某些组分重排占优势,重排多样性受限制,可出现寡克隆信号。 假克隆和寡克隆信号表现：弱条带或两条以上条带 辨别方法： 多次重复，大小不同的条带 只有那些可重复的相同大小的条带是可信的单克隆性条带,3. 假克隆和寡克隆,淋巴瘤重排检出率不是100%假阴性 原因： （1）早期未完成重排；有些类型淋巴瘤缺乏基因重排 （2）引物不全 （3）与其他基因重排、突变； （4）体细胞超突变(eg. MCL vs FL) （5）检测敏感性限制 （6）所用检测技术分析技术 （7）不合适的退火温度 解决办法：多组引物组合， 仔细分析,仅用一对引物时,5假阳性： 技术原因；PCR法影响因素多，严格分区 各种原因所致的假克隆或寡克隆,设计A,设计B,专门人员：完善技术和内容 专门空间：防止污染 结果分析：注意可能的陷阱，必要时重复 综合判断：结合形态、免疫表型和病史,谢 谢 !,