《核酸备课用》PPT课件.ppt

第 二 章 核酸的结构和功能,Structure and Function of Nucleic Acid,核 酸(nucleic acid),是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。,一、核酸的发现和研究工作进展,1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素” 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构 1968年 Nirenberg发现遗传密码 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法 1985年 Mullis发明PCR 技术 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP) 1994年 中国人类基因组计划启动 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,二、核酸的分类及分布,第一节 核酸的化学组成及其一级结构The Chemical Component and Primary Structure of Nucleic Acid,核酸的化学组成,1. 元素组成 C、H、O、N、P（910%）,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine, A),鸟嘌呤(guanine, G),碱 基,嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),戊 糖,核苷：AR, GR, UR, CR 脱氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR,一、核苷酸的结构,核苷酸： AMP, GMP, UMP, CMP 脱氧核苷酸： dAMP, dGMP, dTMP, dCMP,体内重要的游离核苷酸及其衍生物,含核苷酸的生物活性物质： NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP,多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP,环化核苷酸: cAMP，cGMP,C,G,A,二、核酸的一级结构,定义 核酸中核苷酸的排列顺序。 由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。,书写方法,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,目 录,第二节 DNA的空间结构与功能Dimensional Structure and Function of DNA,DNA的二级结构-双螺旋结构 DNA双螺旋结构的研究背景和历史意义 DNA双螺旋结构模型要点 DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装 DNA的超螺旋结构 原核生物DNA的高级结构 DNA在真核生物细胞核内的组装 DNA的功能,一、 DNA的二级结构 双螺旋结构,（一）DNA双螺旋结构的研究背景,目 录,James Watson (L) and Francis Crick (R), and the model they built of the structure of DNA. Image from the Internet,（二） DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）,DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。螺旋直径为2nm，形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)相间。,目 录,（二） DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）,碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T; GC） 。 相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。,目 录,（二） DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）,氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。,目 录,碱基互补配对,T,A,G,C,（三）DNA双螺旋结构的多样性,目 录,1. B-DNA atson和Crick是以在生理盐溶液中抽出的DNA纤维在92相对湿度下进行X射线衍射图谱为依据进行推设的。在这一条件下得出的DNA称B构象。这也是最常见的DNA构象，简称B-DNA。是DNA纳盐。 2. A-DNA 及其他右手螺旋DNA A构象: 钠、钾或铯作反离子，相对湿度75，DNA分子的X射线衍射图。不仅出现于脱水DNA中，还出现在RNA分子中的双螺旋区域的DNARNA杂交分子中。 C构象: 锂作反离子，相对湿度66。仅在实验室中观察到，还未在生物体中发现。如果DNA分子中G-C碱基对较少，这些分子将取D和E构象。 这些研究表明DNA的分子结构不是一成不变的，在不同的条件下可以有所不同。不同构象的DNA都有共同的一点：即它们都是右手双螺旋；两条反向平行的核苷酸链通过atson -Crick碱基配对结合在一起；链的重复单位是单核苷酸；这些螺旋中都有两个螺旋沟，分为大沟与小沟，只是它们的宽窄和深浅程度有所不同。,2.2.3 DNA结构的多态性,右手螺旋：A-DNA，B-DNA，C-DNA，D-DNA， E-DNA， 左手螺旋：Z-DNA,3 . Z-DNA 1979年，Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG单晶的X射线衍射图谱时分别发现这种六聚体的构象与上面讲到的完全不同。它是左手双螺旋，在主链中各个磷酸根呈锯齿状排列，有如“之”字形一样，因此叫它Z 构象 （Zigzag）。 这一构象中的重复单位是二核苷酸而不是单核苷酸；而且ZDNA只有一个螺旋沟，它相当于B构象中的小沟，它狭而深，大沟则不复存在。 轴心线在碱基对之外。,A,B,Z,12,二、DNA分子的高级结构,（一）单链核酸形成的二级结构,有些病毒基因组由单链DNA或RNA组成。单链核酸也可由于部分序列之间的碱基配对而形成分子内或分子间的双螺旋区域。 当同一个核酸分子中一段碱基序列附近紧接着一段它的互补序列时，核酸链有可能自身回折配对产生一个反平行的双螺旋结构，成为发夹（hairpin）。,（二）反向重复序列与二级结构,反向重复序列(inverted repeat) 又称回文结构，指在双链DNA序列中按确定的方向阅读双链中的每一条链的序列都是相同的。 5GGTACC3 3CCATGG5 在DNA中，如果两条互补链分开，每条链上的互补序列都有机会发生碱基配对而形成一个发夹。两个相对的发夹结构形成了一个十字形结构。,回文结构DNA序列中以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同的双螺旋结构。即对称轴一侧的 片段旋转180°后，与 另一侧片段对称重复。 回文结构能形成 十字结构和发夹结构,AATTCAAGGGAGAAGTATAGAAGAGGGAAGGATC TTAAGTTCCCTCT TCATATCT TCTCCCTTCCTAG,存在于同一股上的某些DNA区段的反向重复序列。此序列各单股中没有互补序列，不能形成十字型或发夹结构。,*镜像重复,三、DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装,（一）DNA的超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix 或supercoil) DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,DNA的高级结构 指DNA本身的进一步盘绕成超螺旋的结构，形成特定的空间结构 DNA的超螺旋 负超螺旋 松弛DNA 正超螺旋 空间结构改变 10bp/螺旋 空间结构改变,拓扑异构酶 or溴化乙锭,拓扑异构酶 or溴化乙锭,轴心在中心,DNA扭曲与 双螺旋相同,DNA扭曲与 双螺旋相反,DNA双螺旋额外多或少转几圈，空间机构改变，产生额外张力得不到释放，导致原子空间重排，造成扭曲超螺旋。,在电场的作用下，相同分子量的超螺旋环状DNA比线性DNA迁移率大，线性DNA迁移率大于开链DNA。,琼脂糖电泳,意义 DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。,（二）原核生物DNA的高级结构,原核生物染色体,较简单，只有一个核酸分子（DNA或 RNA），大多呈环状。 与蛋白质结合。转录、翻译可以同时同 地进行，在细胞质中完成，因此，转录、 翻译速度快。,（三）DNA在真核生物细胞核内的组装,真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是 核小体(nucleosome)。,核小体的组成 DNA：约200bp 组蛋白：H1 H2A，H2B H3 H4,真核生物染色体,染色质的基本结构；串珠模型: 1、核心颗粒： 由H2A、H2B、H3、和H4四种组蛋白各以两个分子组成的八聚体和盘绕其表面的DNA双螺旋组成。 2、连接丝:DNA双链 3、组蛋白H1,串珠模型 DNA+组蛋白 核小体 螺旋体（30nm fiber) 超螺旋体(300nm loop) 染色体 (人类总DNA长度=180cm),140bp, 八聚体, 1.75, 缩短7倍,螺旋化,缩短6倍,进一步螺旋化,缩短40倍,盘绕.缩短4倍,串珠模型,非组蛋白在稳定高级结构起作用，可能是骨架蛋白，30nm的基质,三、DNA的功能,DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。,第三节 RNA的结构与功能,Structure and Function of RNA,RNA的种类、分布、功能,一 、信使RNA的结构与功能,内含子 (intron),* mRNA成熟过程,外显子 (exon),目 录,* mRNA结构特点,1. 大多数真核mRNA的5´末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C´2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,2. 大多数真核mRNA的3´末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,帽子结构,mRNA核内向胞质的转位 mRNA的稳定性维系 翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,* mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,* tRNA的一级结构特点 含 1020% 稀有碱基，如 DHU 3´末端为 CCA-OH 5´末端大多数为G 具有 TC,二、转运RNA的结构与功能,N,N二甲基鸟嘌呤,N6-异戊烯腺嘌呤,双氢尿嘧啶,4-巯尿嘧啶,稀有碱基,* tRNA的二级结构 三叶草形 氨基酸臂 DHU环 反密码环 额外环 TC环,氨基酸臂,额外环,tRNA的二级结构： 三叶草形状 RNA三叶草型的二级结构可分为：氨基酸接受区、反密码区、二氢尿嘧啶区、TC区和可变区。除氨基酸接受区外，其余每个区都含有一个突环和一个臂。如图所示：,* tRNA的三级结构 倒L形,* tRNA的功能 活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,tRNA的 三级结构： 倒“L”形，所有的tRNA折叠后形成大小相似及三 维构象相似的三级结构，这有利于携带的氨基酸的tRNA进入核糖体的特定部位。 如图所示：,* rRNA的结构,三、核蛋白体RNA的结构与功能,* rRNA的功能参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。,* rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA,原核生物 5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA,核蛋白体的组成,四 、其他小分子RNA,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。,snmRNAs,snmRNAs的种类 核内小RNA（snRNA） 核仁小RNA（snoRNA） 胞质小RNA（scRNA） 催化性小RNA 小片段干涉 RNA,snmRNAs的功能 参与hnRNA和rRNA的加工和转运。,核 酸 的 理 化 性 质 The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid,第 四 节,目 录,一、核酸的一般理化性质,（一）核酸具有大分子的一般特性。 表示核酸分子的大小通常用： 1.分子量道尔顿 2.碱基或碱基对（bp）数 3.链长（m） 4.沉降系数（s） 相互关系为： 1bp=660道尔顿； 1m双链DNA=3 000bp或2×106道尔顿。,（二）核酸分子中含有酸性磷酸基和碱基上的碱性基团，故为两性解离电解质。通常表现为酸性。因此可利用电泳和离子交换法分离不同的核酸。 （三）核酸分子中碱基含有共轭双键，具有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm处。此特性用于核酸的定性、定量分析。,1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,OD260的应用,目 录,二、DNA的变性(denaturation),定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、 酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：,OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失,目 录,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,目 录,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。,目 录,Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)。其大小与G+C含量成正比。,目 录,三、DNA的复性与分子杂交,DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,减色效应 DNA复性时，其溶液OD260降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,目 录,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,核酸分子杂交(hybridization),核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础,第 五 节 核 酸 酶 Nuclease,核酸酶是指所有可以水解核酸的酶 依据底物不同分类 DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)： 专一降解DNA。 RNA酶 (ribonuclease, RNase)： 专一降解RNA。 依据切割部位不同 核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。 核酸外切酶：5´3´或3´5´核酸外切酶。,参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程 负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 体外重组DNA技术中的重要工具酶,生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解,核酸酶的功能,核 酶,催化性DNA (DNAzyme) 人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。,催化性RNA (ribozyme) 作为序列特异性的核酸内切酶降解mRNA。,1.DNA碱基配对规律有哪些内容？ 2.将核酸彻底水解后可得到哪些组分？ DNA与RNA水解产物有何区别？ 3.试述DNA双螺旋结构的基本内容？ 4.RNA主要有几种？ 每种RNA的结构特点及有何功用？ 5.何为Tm值？其影响因素有哪些？ 6.DNA变性的指标有哪些？引起变性的因素是什么？,