《核酸的研究方法》PPT课件.ppt

核酸的研究方法,核酸的分离、提纯和定量测定,核酸的超速离心,核酸的凝胶电泳,核酸的核苷酸序列测定,DNA聚合酶链式反应（PCR）,DNA的化学合成,制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用,一、核酸的分离、提纯和定量测定,真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，细胞破碎后采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。 DNA沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇,（一）DNA分离纯化,也可用SDS破碎细胞，蛋白酶K降解蛋白后，苯酚抽提，再用RNase分解除去RNA而获得纯化的DNA。,制备RNA时，最重要的是使RNase灭活： 容器用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。然后经过高温处理。 DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性； 加入强变性剂（如胍盐：可使所有蛋白质变性）使RNase失活； 在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin),（二）RNA的分离, 用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白 用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提：异硫氰酸胍是极强的蛋白质变性剂。后用苯酚和氯仿多次除净蛋白质 用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心，蛋白质在最上面，DNA在中间，RNA沉在底部 mRNA的制备： oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法,制备RNA的方法：,（三）核酸含量的测定,2、定糖法 RNA：核糖 糠醛 绿色物质（670-680nm） DNA：脱氧核糖+二苯胺兰色物质（595-620nm）,苔黑酚/地衣酚,浓HCl,浓硫酸,1、紫外吸收法 1个A50g/ml 双链DNA 40g/ml RNA或单链DNA,3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸 4、琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比,细胞或组织中核酸含量测定方法,纯DNA 比值1.8， 1.8 Pr、苯酚污染 纯RNA 比值2.0， 2.0 DNA、 Pr、苯酚污染,（四）、核酸纯度的测定,OD260OD280,二、核酸的沉降特性与超速离心,利用超离心技术，可以测定核酸的沉降常数和相对分子质量。密度梯度沉降平衡超离心法在核酸分子构象的研究中应用颇广。DNA分析时，常用氯化铯密度梯度。主要应用于以下方面： 核酸密度的测定 测定DNA中的G-C含量 溶液中核酸构象的研究 用于核酸的制备,8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 =0 +4.22（r2 - r02） × 10-10 ：未知DNA的密度 0：为标准DNA的密度 ：角速度（弧度/秒） r：样品到转轴的距离 r0：已知DNA到转轴的距离,（一）核酸密度的测定,G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系，因此可用能用该方法计算DNA碱基成分，计算公式为： =0.1 xG-C + 1.658 xG-C =（-1.658）× 10 需注意的是： 含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值，不能用该公式计算。,（二）测定DNA的G-C含量,RNADNA 变性DNA双链DNA 蛋白质， 变性程度越大，浮力密度越大,（三）研究核酸的构象,（四）用于核酸的制备,不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来，利用EB（溴化乙锭）与核酸结合，能在紫外灯下发出荧光的特性，将目的区带收集。,是当前核酸研究中最常用的方法。有许多的优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。,三、核酸的凝胶电泳,（一）琼脂糖凝胶电泳,用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分离范围广。,电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.71%） （3）DNA的构象：超螺旋线状分子开环状分子 （4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（430都可以，常室温进行） 琼脂糖凝胶电泳常用于DNA分析；分析RNA时需加入蛋白质变性剂甲醛。电泳完毕用溴化乙锭（0.5g/mL）染色，用紫外光检测,琼脂糖电泳用于DNA分子量的测定,在同一凝胶中加入已知相对分子质量的样品（分子marker) ，在电泳完成后，通过染色，照相，从照片上比较待测样品的DNA片段与标准样品的中的已知大小片段，可以推测待测未知DNA片段的分子大小。,用于小片段DNA的分析 相对分子质量小于1000bp的DNA片断和RNA的电泳。 PAGE中一般不含RNase，用于RNA分析时不会分解样品。,（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,（一）DNA的酶法测定,四、核酸的核苷酸序列测定,英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖 1975 设计出DNA测序法，1980 获诺贝尔化学奖 合成一系列与待测DNA序列互补的DNA片段群。,末端终止法Sanger 2，3双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成链延伸的抑制剂。,DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP,（二）DNA的化学法测序：由Maxam和Gilbert所发明。其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，可使末端标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱,4组特异的反应如下： （1）G反应：用硫酸二甲酯DMS使鸟嘌呤上的N7原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂 （2）G+A反应：用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂 （3）T+C反应：用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基 （4）C反应：当有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂,（三）RNA的测序 RNA的测序方法有3个： （1）用酶特异切断RNA链： 胰RNase A：嘧啶核苷酸键 米曲霉RNase T1：鸟苷酸核苷酸键 黑粉菌RNase U2：腺苷酸核苷酸键 多头黏菌RNase Phy I：A、G、U核苷酸键 （2）用化学试剂裂解RNA（与DNA化学测序法类似） （3）逆转录成cDNA,1995年K.Mullis发明。基本步骤为： 1.设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA序列，并尽量减少可能产生的非特异产物 2.优化反应体系：包括适量模板、引物、4种dNTP、耐高温的DNA聚合酶和适量Mg2+,五、DNA聚合酶链式反应（PCR）,3.选择3个温度进行热循环： 变性94，4560s； 退火，根据引物的Tm，一般为两引物中较低的Tm值减2，1min； 延伸，72，1min。热循环25-30个周期，最后延伸10分钟。 4.扩增完成后取出一定量的反应产物，检测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙啶染色，紫外光下检测结果,y=产物；x=扩增效率；n循环次数,PCR技术十分灵敏，扩展效率非常高，通常可扩增106倍，其扩增产量可按下列公式计算。,PCR技术的应用-： （1）遗传病和某些疑难病的诊断以及孕妇的产前检查 （2）病原体的检测 （3）法医和刑侦鉴定 （4）癌基因的检查 （5）基因组探针的制备 （6）基因组测序、染色体巡视 （7）cDNA库的构建 （8）基因突变的分析和定位诱变 （9）DNA重组 （10）基因的分离和克隆,六、DNA的化学合成,P521图15-6固相合成法（亚磷酸三酯法）合成DNA 合成方向：3 5端 5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。 3-OH用氨基亚磷酸化合物活化 碱基上氨基用苯甲酸保护,二对甲氧三苯甲基,