病理切片的制作课件

,病理切片的制作,病理切片的种类,1石蜡切片 2冰冻切片 3震动切片 4火棉胶切片 5塑料切片,病理切片的制作过程,冰冻切片 石蜡切片 火棉胶切片 取 材 固 定 冰 冻 冲 水 脱 水 透 明 乙醚酒精 浸 蜡 胶液渗透 石蜡包埋 火棉胶包埋 冰冻切片 切 片 切 片 染 色 染 色 染 色 封 固 封 固 封 固,取材,1取材刀具必须锋利。 2切取标本不应该挤压和揉擦，不应使用有钩镊子或血管钳等手术器械镊取标本，应选择病变或可疑病变的组织。必要时选取病变与正常组织交界处。 3切取标本的原则是求准而不是求量多以不超过15x15mm为佳，厚度以35mm为度， 4取材要及时，组织块必须争取时间及时固定。组织的固定以愈新鲜愈好。 5取材时对大体标本（肉眼标本）绘制图象，进行仔细描述。包括形状、大小，硬度，颜色，病灶（或可疑病变）部位对所取的组织应定位编号。 6切取各组织块时，切勿挤压损伤，对典型或具有教学和科研价值的肉眼标本， 7不能因取材而对标本造成人为的“病变”。肠粘膜组织上沾有少量粪便，也不应以手拭去或以水洗去。 8固定液的量要充足，应为固定组织的10倍。 9组织采取应在正常与病灶交界之处。组织形状最好为方形或长方形状，这样有利于制片。切不可以形状定位，组织厚薄要均匀。 10各组织块应包括各脏器的重要结构，如肾脏组织包括皮质部分和髓质部分。在有浆膜的脏器（如胃等）组织块中，要至少有一块带有浆膜。 11组织内的钙化病灶或骨质，应在充分固定之后进行脱钙，组织内的非病理性异物应予剔除。,固定的目的,能防止细菌的腐蚀和组织的自溶 保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖元等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。 使组织硬化，便于切块。 对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散 保存好大体标本。 可增强染色的作用。,固定剂的种类,类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。 类：氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。 类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。 类：其他，氯化汞，苦味酸等。 类 ：蛋白沉淀，丙酮 等。,固定剂的选择,1、渗透性强 2、组织在固定液的作用下，不应发生显著的收缩和膨胀现象。 3、固定剂应该有利组织切片和染色，（1）固定剂对固定后的组织应有利于染色剂的染色。 (2)固定剂能将组织或细胞中某些必须观察的成分予充分固定而保存下来，以便染色。 4、固定液应该同时也是一种较好的保存液。,固定的方法,浸泡固定法 灌流固定法 微波固定法 蒸汽熏蒸固定法,固定注意事项,1.组织块不宜过大，一般以厚度5mm，长宽不超过15×15mm。 2.固定液的量一般以组织块大小的20倍为宜， 3.必须选择渗透力强，又不是组织过度收缩或膨胀的试剂作为固定液。 4.固定时间的长短因固定剂的不同要求而定，也与气温、组织块的大小有关。 5.特殊要求的组织，常需特殊的固定液，,冲洗时应注意以下事项,水溶性的固定剂：需用流水冲洗。 酒精溶剂的固定剂：应用同浓度的酒精浸洗。 含苦味酸的固定剂：（苦味酸与甲醛混合液除外），须用70酒精浸洗，以免水洗后固定作用消失。 含有升汞固定剂：组织经固定后应在冲洗剂水或酒精中加碘以洗去组织内汞的沉淀。 含有铬酸的固定剂：组织在冲洗时最好置于暗处，以免产生沉淀或使组织硬化而影响制片。,石蜡切片的制作,脱 水 透 明 浸 蜡 包 埋,脱 水,目的 常用的脱水剂（酒精 ,丙酮 ,正丁醇 ,二氧乙环 ） 脱水的基本原则：从低浓度酒精开始逐渐升到高浓度酒精，以保持组织中的水分完全脱净。,透 明,目的 透明剂：常用的有二甲苯，苯，甲苯，氯仿，香柏油等 透明时间的长短因组织的大小而异。例如脑组织和有血块的组织，就应该缩短在二甲苯内留置时间，而一些肌肉组织和胃肠组织则应该稍延长在二甲苯内留置时间，最好先投入酒精和透明剂等量混合液半小时，再入透明剂，并更换一次透明剂，待组织完全透明后进行浸蜡，一般需要半小时至23小时。,浸 蜡,概念 5460.C 较厚的组织需要较长时间才能使蜡浸入中心，而且厚的组织常带入的透明剂比较多，故需要多次浸蜡才能将透明剂除去。即使少量透明剂也会沾污石蜡而产生结晶，致使切片时切片易碎裂。为了尽可能排除透明剂，浸蜡可以分两级或三级进行。以熔点较低的软石蜡作为第一步，然后再换为熔点较高的石蜡作为第二步，第三步。,包埋,将脱水、透明、浸蜡以后的组织块 用石蜡包埋，制成适当硬度的石蜡块，以便切成薄片。,包埋注意事项,1新蜡应在温箱内熔化一次，使其中所含的挥发性物质蒸发，以免包埋冷凝时发生“蜡花”，即蜡块中呈不均匀现象，而不能切片； 2石蜡凝结过程中，将包埋容器放入水中时动作要慢； 3制作切片时，夏天用硬蜡包埋，冬天可用软蜡包埋；软的组织用软蜡，硬的组织用硬蜡。 4一般组织常用的包埋蜡熔点5260的石蜡，如果需要切4um以下的切片，则用5660的石蜡，较厚的切片（如胚胎连续切片）则用熔点5254的石蜡。,包埋 注意事项 2,5.作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求再60。C左右。 6.包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏，使得组织变硬，变脆，并发生卷曲，收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度，两者是否合适，温度不一致常可造成组织与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。 7.包埋用石蜡应掌握用量，以组织全部包埋完毕，石蜡也恰好用完为宜。 8.包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。 9.囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位，应将组织块直立拉平，不要卷曲。 10.相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意方向的一致，以利切片。 11.多块组织和碎组织包埋于一个蜡块内时，组织的排列一定要密挤靠拢，以求成直线或方块行，这样有利于切片。 8.石蜡包埋后，不宜冷凝过慢，特别是室温较高时，石蜡凝固后应立即投入冷水中加速冷却可增加石蜡密度，韧性和硬度。但冷凝过速也会因为内外温差过大造成蜡块裂损。,石蜡包埋程序,1 组织取材2毫米厚度，固定于福尔马林数小时后再换以新鲜福尔马林固定数小时。 2 组织流水冲洗612小时。 3 70酒精24小时。 4 80酒精24小时。 5 95酒精（）24小时。 6 95酒精（）24小时。 7 100酒精（）24小时。 8 100酒精（）2小时。 9 二甲苯（）0.51小时。 10 二甲苯（）0.5小时。 11 浸蜡（）2小时。 12 浸蜡（）2小时。 13 组织包埋。,石蜡切片的制作,切片前的准备 粘片,切片前的处理,准备用品 调整 切片机 修切石蜡块,粘片,粘片的目的是将石蜡切片粘附在载玻片上，借水的张力和一定的温度，使略皱的蜡片伸展平整，以便染色、镜检。,石蜡切片常遇到的困难及矫正,1 切片不能形成蜡带，因室温过低。石蜡过硬和石蜡粘度不足。蜡边过小或不平。可在石蜡内加一定比例的蜂蜡，使石蜡的粘度增加。 2 蜡带弯曲，蜡带的两侧大小不等，刀不锐利。 3 蜡片成卷：刀不锋利或不清洁，刀的倾斜过大或石蜡过硬。 4 切片出现褶皱：石蜡太软或浸蜡不够，刀钝或倾斜度过小。 5 切片薄厚不等：组织在脱水及浸蜡过程中处理不当，刀钝或切片机不佳或刀和组织块固定牢固。 6 组织块中的结缔组织呈不透明的白色状态而破碎：脱水不彻底，透明不足而影响石蜡浸透。 7 切片呈碎卷状：脱水，透明及浸蜡时间过久或蜡温过高。 8 切片出现纵纹：刀刃有小缺口，石蜡不清洁，组织内有钙盐沉积。 9 切片出现皱纹：组织固定不牢，刀与刀台固定不紧。 10 蜡块底边成白色：刀的倾斜不足而碰撞的结果。 11 切片粘刀：刀刃不解，可用软布或手指沾二甲苯以反刀口方向向刀口抹掉，稍加大刀倾斜度，刀钝。 12 蜡块向上运行时带走切片：刀钝，刀刃背面沾积有蜡，室温高或用冰块冷却蜡块，也可能是蜡带的静电反应（室内过于干燥）。,冰冻切片的制作,(一)冷冻切片的种类 (二)冷冻切片的目的 （三）冷冻切片的制作方法,冷冻切片的种类,冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法，半导体致冷的冰冻切片等,冷冻切片的目的,（1）在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。 （2）了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。 （3）对于已确定为恶性肿瘤的患者，则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤组织。 （4）在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。 （5）显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。 （6）某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。 （7）神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。 （8）对某些物质所进行的免疫荧光的研究。,冷冻切片的制作方法,取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为15×15mm。 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在510um间。 调好防卷板。 应视不同的组织选择不同的冷冻度。,冰冻切片时的注意事项,防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。 多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。 放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。 组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。 当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。 用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。,冰冻切片与空洞,1成因 2 消除办法,成因,切片上行成空洞是由于在冰冻组时织形成冰晶引起的，当冰晶溶解后在切片上留下空洞,消除办法,1在冰冻前用20-30%的蔗糖浸泡组织； 2速冻法 1）液氮2）干冰-丙酮 。,