《流式细胞凋亡分析》PPT课件.ppt

流式细胞凋亡分析,概 念,细胞凋亡（apoptosis）是指有核细胞在一定条件下通过启动其内部自身机制，主要是通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，是生物体中一种普遍存在的现象。,概 念,细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功能活动所必需的，是多细胞生物生命活动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以存活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。,概 念,细胞凋亡与细胞坏死（necrosis）是细胞死亡的两种模式，但两者有明显的区别。后者是由于细胞受到严重损伤或或大剂量细胞毒药物作用后发生的被动分解过程，并可导致周围组织的炎症反应。,概 念,细胞凋亡的作用主要包括以下几方面： 清除无功能的细胞； 控制细胞数量； 清除病态的或有害的细胞； 清除多余的细胞；,细胞凋亡的特征,形态学特征： 光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细胞核双链DNA发生裂解所致。,细胞凋亡的特征,形态学特征： DNA降解后，形成长度主要为180-200bp的DNA片断，随后细胞裂解成许多有膜包被的小体，称为凋亡小体（apoptotic bodies),最后被巨噬细胞吞噬，但不会引起周围组织的炎症反应。凋亡小体是凋亡细胞特征性的标志。如在显微镜下观察到凋亡小体，则可确认为细胞发生了凋亡。,细胞凋亡的特征,形态学特征： 电镜下，细胞核内可见高电子密度区，这是核DNA在核小体连接处断裂成核小体后，在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。染色质聚集区以外的低电子密度区为透明区，是由于核孔变大导致其通透性增加，细胞质中水分不断渗入而造成。线粒体增殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋亡细胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架变得致密、紊乱。,细胞凋亡的特征,形态学特征：,细胞凋亡的特征,细胞凋亡的特征,形态学特征： 共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位和线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细胞膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,ps)和凝血酶敏感蛋白等，这些分子的出现与凋亡细胞的清除有关。,细胞凋亡的特征,形态学特征： 凋亡细胞另一个形态特征通过总DNA提取，DNA凝胶电泳分析，可呈现出梯状图谱，可见清晰的DNA梯子(ladder)。,细胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： 细胞凋亡的发生和发展过程也可能是水解酶级联切割的过程，它将大分子结构的物质如DNA、细胞骨架水解变性成小分子碎片，致使细胞发生凋亡。,细胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： 其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要作用。它具有一段携带活化位点的保守氨基酸序列，可以特异性识别、切割天冬氨酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具有相同的结构和功能特性而被称为caspase。,细胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： caspase可能在凋亡细胞的形态变化中起了主导作用。Caspase通常是以酶原形式存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转化为有活性的酶，活化的caspase进一步激活其他的caspase前体，形成了级联放大切割过程，裂解重要的大分子物质，导致凋亡。,细胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： 目前已发现15个caspase家族成员，分别命名为caspase-115，并根据其功能特点分成两类，即启动caspase(caspase-2、8、9、10）和效应caspase(caspase3、6、7）。,细胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： 启动caspase作用于凋亡信号触发后上游的不可逆位点。效应caspase由启动胱冬肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这两部分影响线粒体，通过线粒体方式执行凋亡的信号。bcl-2家族成员能调节执行位点的进程。,细胞凋亡的特征,生化特征： 1 caspase蛋白酶： caspase-3是最重要的指示蛋白酶，为17kD和12kD亚单位组成的异二聚体。活化的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他caspase、相关的胞质靶位点（细胞因子18，CK18)和细胞核靶位点。Caspase-3切割CK18是凋亡过程中caspase切割发生的早期指示因子。,细胞凋亡的特征,生化特征： 2 核酸内切酶的激活： 细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激活，将核小体间连接DNA降解，形成长度主要为180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，组蛋白和其他核内蛋白质不降解，核基质也不改变。在DNA凝胶电泳分析中呈现出特征性“梯状”条带，而细胞坏死时，DNA片断大小不一，无“梯状”条带出现。但并非所有凋亡细胞都能检测到这种典型的生化特征。,细胞凋亡的特征,生化特征： 2 核酸内切酶的激活：,细胞凋亡的特征,生化特征： 3 线粒体的变化： 线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱导因子使线粒体通透性升高，膜上巨型通道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中，线粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体膜电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶联。,细胞凋亡的特征,生化特征： 3 线粒体的变化： 线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡的早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧质子和其他离子分布不对称造成的。线粒体参与了凋亡的调控和实施。与凋亡密切相关的bcl-2家族分布在细胞内膜系统，其中线粒体外膜上分布最多，bcl-2具有抑制线粒体通透性变化的能力，并通过此途径抑制细胞凋亡。,细胞凋亡的特征,生化特征： 4 胞质Ca2+和pH的变化： 细胞内Ca2+和H+浓度的稳定对维持生命活动至关重要。胞内Ca2+库的释放，胞质Ca2+与细胞凋亡关系密切。胞外Ca2+内流促使胞质Ca2+持续升高，作为凋亡信号启动凋亡发生。,细胞凋亡的特征,生化特征： 4 胞质Ca2+和pH的变化： 此外，Ca2+的释放打破了细胞内结构的稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分开始和细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而触发细胞凋亡。,细胞凋亡的特征,生化特征： 4 胞质Ca2+和pH的变化： 细胞pH的变化可影响细胞凋亡。细胞凋亡时伴随胞质pH降低，胞质酸化影响细胞凋亡。胞质pH降低可能与胞质Ca2+升高有关。胞质酸化主要通过激活酸性DNase启动细胞凋亡。pH降低也影响了一些酸性功能蛋白在细胞凋亡过程中的作用。,细胞凋亡的基因调控,细胞凋亡受基因的调控，其机制非常复杂。凋亡基因可分为两类： 1诱导基因：野生型p53基因、c-myc、细胞表面抗原基因Apo-1(Fas)等 2抑制基因：bcl-2、突变型p53基因和ras基因等,细胞凋亡的基因调控,上述两类基因蛋白产物的表达对凋亡起重要调控作用。诱导基因蛋白产物表达上调，可提高细胞对凋亡信号的敏感性，促进凋亡发生。抑制基因蛋白产物表达，可降低细胞对凋亡信号的敏感性，抑制或推迟凋亡。,细胞凋亡的基因调控,诱导与抑制凋亡两大基因蛋白表达的平衡，可对细胞的增殖、分化和死亡进行调控，维持细胞群体的正常稳定性。当调控失衡时，就会导致疾病，如肿瘤、AIDS、霍奇金淋巴瘤等。,细胞凋亡的基因调控,常见的凋亡基因及其蛋白： 1 bcl-2 是研究最早的与凋亡有关的基因。 bcl-2基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制作用的癌基因。它是阻止细胞死亡的最后途径，而对细胞周期无明显影响。它能抑制由许多因子，如化疗药物、某些病毒、p53、c-myc及生长因子等激发的凋亡。,细胞凋亡的基因调控,常见的凋亡基因及其蛋白： 2 p53 p53基因不仅是一种与肿瘤发生、发展相关的抑癌基因，而且参与细胞生长、分化及死亡的调控。P53在调节凋亡中起重要作用。正常细胞和肿瘤细胞在受到紫外线或gamma射线照射后，含正常p53的细胞，可发生凋亡，而p53基因缺失或突变的细胞则表现出对电离射线和化疗药物的抗性。野生型p53对凋亡起促进作用，突变型p53对凋亡起抑制作用。,细胞凋亡的基因调控,常见的凋亡基因及其蛋白： 3 Fas和Fas配体 Fas是肿瘤坏死因子（TNF）受体和神经生长因子受体家族的细胞表面分子。Fas配体（Fas ligand,FasL)是TNF家族的细胞表面分子。FasL与其受体Fas结合导致携带Fas的细胞凋亡。抗Fas抗体、表达FasL的细胞和可溶性的FasL与Fas交联均产生细胞凋亡信息，而bcl-2过度表达能抑制Fas致凋亡作用。,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与肿瘤： 以往，细胞增殖的失调、细胞分化与增殖紊乱被认为是恶性肿瘤的发生机制。近来，人们认识到在肿瘤细胞快速增殖过程中，同时也发生凋亡，增殖与凋亡之间的平衡有可能决定着肿瘤的生长速度。细胞凋亡的减少，在肿瘤发生、发展中起着重要作用。,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与肿瘤： 凋亡调节基因的紊乱、凋亡机制蛋白的增加是肿瘤形成的重要机制。用于调控肿瘤细胞凋亡的基因主要有bcl-2基因家族、p53基因、Fas基因家族和c-myc基因家族。,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与肿瘤： 许多肿瘤，尤其是消化道肿瘤常可见凋亡的发生。凋亡在胃粘膜发生肠上皮化生等病变中起决定性作用，但胃癌的凋亡指数低于慢性胃炎和胃溃疡。因此，胃粘膜病变细胞凋亡减少、生存期延长、细胞大量堆积可能是胃癌发生、浸润及转移的基础。,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与肿瘤： 凋亡还可能与胃癌的血管生成有关。凋亡指数与肿瘤内部微血管密度成负相关，并与胃癌的组织类型有关。,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与免疫系统疾病： 许多以免疫功能异常为主要特征的疾病均存在细胞凋亡现象。细胞凋亡在免疫形态的发生分化以及抗感染免疫和自身免疫病的发生中起重要作用。,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与免疫系统疾病： 当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。在细胞凋亡过程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及CD40/CD40L之间的相互作用起了重要作用。它们通过激活T淋巴细胞的自杀或杀伤激活的B淋巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与免疫系统疾病： 当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。在细胞凋亡过程中，CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及CD40/CD40L之间的相互作用起了重要作用。它们通过激活T淋巴细胞的自杀或杀伤激活的B淋巴细胞，进一步调节免疫反应的强弱。,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与免疫系统疾病： 近来研究发现，淋巴细胞凋亡作用的缺陷与系统性红斑狼疮（SLE）的发生、发展有密切关系。淋巴细胞凋亡的缺陷常是自身基因调控异常的结果。目前已明确定义为自身基因的有Fas和bcl-2等。,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与皮肤病： 某些皮肤病是以凋亡的增加为特征。银屑病表皮的基底膜上层中观察到凋亡的形态学和生化特征。plaque基底细胞层bcl-2阳性细胞数显著下降。,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡与皮肤病： 自身免疫性皮肤病，如皮肌炎、硬皮病等，其免疫异常与自身反应性T、B淋巴细胞凋亡缺陷有关。恶性黑色素瘤的发生、发展与细胞凋亡基因调控失常而导致凋亡障碍有关。此外，细胞凋亡与皮肤肿瘤自动消退有关。,细胞凋亡与疾病,缺血性脑损伤和缺血性心脏病： 以往，脑缺血导致的细胞死亡被认为是由于神经元广泛坏死所致。近来研究表明，全脑或局部脑梗死均激活细胞凋亡过程。大脑半球短暂缺血后，缺血中心区域神经细胞很快坏死，但周围的神经细胞，以海马CAI区的锥形细胞最为明显，要经过一个潜伏期才出现延迟性神经细胞退化，即细胞凋亡。,细胞凋亡与疾病,缺血性脑损伤和缺血性心脏病： 这种凋亡发生在缺血后1-2天，并在缺血周边区域出现bcl-2蛋白的表达。而且，不仅在神经细胞，在胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和血管壁中也有表达，这提示非致死性的损伤导致细胞产生bcl-2，以抵抗细胞的凋亡。此外，在缺血后的脑组织中检测到Fas抗原mRNA明显增加，提示Fas在凋亡中起一定作用。,细胞凋亡与疾病,缺血性脑损伤和缺血性心脏病： 除了细胞坏死以外，凋亡也是缺血性心肌细胞死亡的重要方式。在体心脏实验表明，再灌注损伤和心肌梗死均能诱发心肌细胞凋亡，尤其在梗死早期。心肌梗死的大小取决于细胞凋亡的严重程度，凋亡可能是缺血性心脏病演化为心力衰竭的细胞学机制。,细胞凋亡与疾病,感染性疾病： HIV感染可导致AIDS。其感染的细胞学特征是特异性破坏CD4+T淋巴细胞，造成相关免疫功能缺陷，导致感染和肿瘤。在HIV感染过程中，从HIV对CD4+T淋巴细胞黏附、病毒颗粒进入细胞、HIV基因组在细胞中复制和装配以及出芽释放等环节，都与细胞凋亡密切相关。,细胞凋亡与疾病,其他疾病： 肾小球肾炎和狼疮肾炎动物模型中均发现凋亡细胞，这些凋亡细胞可能与肾小球硬化和肾功能衰竭有关。血管动脉粥样硬化形成过程中，平滑肌细胞的增殖与凋亡同时存在，凋亡对内皮损伤、增殖抑制、粥样病灶的形成和斑块的剥脱有一定的影响。,细胞凋亡与疾病,通过对各种疾病细胞凋亡的研究，使我们对疾病的发生机制有了新的认识，同时也为疾病的治疗提供了新的思路。,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋亡时最可靠的证据，其直接检测方法主要是通过对组织或细胞进行各种染色，然后在光学显微镜或电子显微镜下观察。,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 凋亡细胞的形态学变化是细胞发生凋亡时最可靠的证据，其直接检测方法主要是通过对组织或细胞进行各种染色，然后在光学显微镜或电子显微镜下观察。如通过苏木素-伊红（HE)染色、吉姆萨（Giemsa)染色、甲基绿-哌诺宁染色在普通光学显微镜下观察；通过荧光染料如丫啶橙（AO)、Heochst33258染色在荧光显微镜下观察；或制成超薄切片用电子显微镜观察，以区别凋亡和坏死。,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 FCM可间接观察凋亡细胞形态学变化，主要是根据未经染色的凋亡细胞的光散射特征进行检测。,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 FCM提供的散射光参数主要包括前向散射光（FSC）和测向散射光（SSC）。FSC主要与细胞大小有关，对同一个细胞群体，散射光强的，其细胞大一些，散射光弱的，其细胞小一些。SSC主要与细胞内部颗粒密度有关，颗粒密度越大，SSC就越大，而颗粒密度越小，SSC就越小。,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 当细胞发生凋亡的早期，细胞膜完整、细胞皱缩，因此这一阶段凋亡细胞FSC较活细胞小，而SSC较之增强或无明显变化。,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 当细胞凋亡进一步发展时，细胞皱缩更加明显，核质的变化导致细胞内颗粒密度明显增强，FSC进一步变小，而SSC却明显增大。最终，当凋亡小体形成时，FSC明显缩小。,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 此外，也可通过FSC区分坏死细胞和凋亡细胞。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其FSC增大，SSC在细胞坏死时也增大。但晚期凋亡细胞的FSC和SSC与坏死细胞区分不明显。当坏死细胞的细胞膜破裂，核质丢失，细胞成为碎片时，其FSC和SSC均明显变小。,流式细胞分析细胞凋亡,流式细胞分析细胞凋亡,形态学特征检测 但实际上，由于被检测细胞形态上的均一性和核/质比例不同，凋亡不同阶段的细胞，其光散射参数的变化不同，有时很难准确检测到凋亡细胞。但将光散射参数与荧光标记的抗体或荧光染料结合起来检测细胞凋亡，可以克服单纯的光散射参数的缺点。,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 凋亡细胞的一个重要特点是很长一段时间里细胞膜结构未受影响，其主要表现为：维持膜的基本功能，如离子和大分子的屏蔽作用和具有功能的通道泵。,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 根据不同功能状态下的细胞对染料的吸收或排斥作用不同，可用流式细胞仪定量检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的百分比。,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 处于早/中期的凋亡细胞，仍然保持着完整的质膜及其基本功能，阻碍大分子物质及离子进入细胞内。而晚期凋亡细胞或坏死细胞，其质膜完整性受到破坏，使某些大分子物质及离子可以进入细胞内。因此，根据对DNA染料通透性的不同，可区分处于不同阶段的细胞。,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 PI和EB均属于插入性荧光染料，可选择性的定量嵌入核酸双螺旋的碱基之间，其荧光发射均为橙红色，如果使用氩离子激光488nm激发，PI的发射光谱波长在610-620nm范围，EB的发射光谱波长在603-610nm之间，二者可互相替代，但EB毒性较大。,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 7-氨基-放线菌素D（7-AAD）主要以插入方式与DNA链的G-C碱基对结合，其激发波长约为580nm，最大发射波长为660nm，由于其发射波长较大，可与藻红蛋白（PE）结合，通过单一光谱488nm的激光光源激发，可以进行定量DNA和免疫荧光的双参数分析。,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 由于EB、PI和7-AAD不能进入具有完整细胞膜的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在未固定时对这些染料是拒染的，而坏死细胞胞膜完整性已破坏，可被染色。因此，这些染料可被用来鉴别死细胞和活细胞。,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 赫斯特类染料（特别是HO33342)检测细胞凋亡的原理与上述染料不同。HO33342是双苯并咪唑家族成员之一，能特异与DNA螺旋中富含A-T重复序列结合。HO33342用氪激光激发紫外线荧光，激发光波长为352nm，发射光波长为400-500nm，产生蓝色荧光。,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 HO33342能被活细胞摄取，而其从细胞内排出是一个耗能的主动过程，依赖细胞膜上的P-糖蛋白泵。活细胞染色时，应考虑是否存在细胞抗药性问题，如有耐药性，则染色效果不佳。HO33342进入凋亡细胞比正常细胞多，将其与PI结合对凋亡细胞进行双染，可将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区分开来。,流式细胞分析细胞凋亡,细胞对染料吸收能力的检测 在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现为：正常细胞低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。,流式细胞分析细胞凋亡,caspase的流式细胞仪检测 caspase家族在细胞凋亡过程中起着重要作用，通过caspase对大分子结构的瀑布级联水解反应，导致凋亡发生。其中caspase-3是最重要的指示蛋白酶，活化的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他的caspase、相关胞质的靶位点（CK18）等。Caspase-3切割细胞因子，尤其是CK18，是凋亡过程中caspase切割发生的早期指示因子。,流式细胞分析细胞凋亡,流式细胞分析细胞凋亡,caspase的流式细胞仪检测 caspase-3的活性在细胞凋亡发生前是检测不到的，只有在凋亡早期才能检测到。随后在凋亡的过程中持续升高，在凋亡晚期快速下降。因此，对caspase-3的连续检测可动态观察凋亡的整个过程。,流式细胞分析细胞凋亡,线粒体功能的检测 线粒体被认为是凋亡生化反应的基地，因为它可能是决定细胞存活或死亡的中心。线粒体的一个重要作用是在外膜形成通透性通道孔（线粒体大通道），允许线粒体内的蛋白流入胞质。线粒体大通道的开放，导致质子在内膜两侧的不对称分布被破坏，即线粒体跨膜电位（TMP）被转变。,流式细胞分析细胞凋亡,线粒体功能的检测 TMP的变化是凋亡早期特有的现象。TMP由膜内外包括质子在内的离子形成的。内膜内面带负电，因此带正电的亲脂性荧光素会集中分布于线粒体基质。凋亡早期TMP的变化导致其聚集荧光色素的能力丧失。其发生要早于DNA断裂和PS外翻。,流式细胞分析细胞凋亡,线粒体功能的检测 TMP的变化可通过适于流式细胞仪检测的荧光染料来检测。多种膜通透性亲脂阳离子荧光色素，如罗丹明123（RH123）被用于流式细胞仪检测TMP的探针。当它们与活细胞一起培养时，探针被聚集于线粒体，通过测定细胞荧光色素的强度及外流来反映TMP的变化。,流式细胞分析细胞凋亡,线粒体功能的检测 位于线粒体的启动凋亡和抑制凋亡的bcl-2/bax家族蛋白通过形成同源性或异源性二聚体在线粒体跨膜电位的调控中起重要作用。所有bcl-2家族蛋白都可通过特异性抗体进行FCM测定。,流式细胞分析细胞凋亡,线粒体功能的检测 线粒体在凋亡时的变化及与bcl-2家族蛋白之间的相互作用发生于凋亡早期，影响细胞对凋亡的敏感性。bcl-2家族蛋白可能影响抗肿瘤治疗的转归。因此，流式细胞仪检测这些变化，在肿瘤学上具有一定意义。,流式细胞分析细胞凋亡,细胞内Ca2+的检测 细胞发生凋亡时，其胞质内Ca2+浓度升高，pH调节能力丧失，导致细胞磷酸化。目前有许多检测细胞内Ca2+浓度的方法，但通过流式细胞仪采用Ca2+选择性的荧光探针（Flu-3）检测细胞内Ca2+浓度仍是最佳方法。,流式细胞分析细胞凋亡,细胞DNA含量的检测 使用PI荧光染料通过流式细胞仪进行细胞DNA含量测定，会出现一亚二倍体细胞峰（sub-population),为DNA低染色的细胞群，其峰值低于正常G0/G1区域。DNA染色能力降低主要是由于内源性核酸内切酶激活及低分子量DNA流失。,流式细胞分析细胞凋亡,细胞DNA含量的检测 用于检测DNA含量的特异性荧光染料包括PI、EB、7-AAD、HO33342、DAPI等。凋亡细胞DNA信号代表核基质上黏附着剩余核小体，交联固定剂如甲醛能阻止凋亡细胞DNA外漏，因此不应使用。,流式细胞分析细胞凋亡,细胞DNA含量的检测 DNA特异性荧光染料可与其他荧光单克隆抗体同时应用，而且可通过使用温和的乙醇固定方法同时进行DNA和免疫表型分析，虽然不是很特异，但快速、操作简单。,流式细胞分析细胞凋亡,蛋白含量的检测 凋亡细胞蛋白含量也会下降，其与DNA含量减少同时发生。凋亡过程中的蛋白水解是DNA降解所必需的。细胞蛋白的浓度可用不同的酸性染料如异硫氰酸荧光素（FITC）测定，它主要与氨基基团结合，很少与碳水化合物及脂质反应。,流式细胞分析细胞凋亡,膜磷脂重分布的检测 细胞发生凋亡时，细胞膜的结构发生变化较早，主要表现为细胞膜内外不同的磷脂基团重分布。在正常活细胞状态下，细胞膜维持两侧的磷脂不对称分布，细胞外膜PS完全缺如。这一稳定状态主要是由于细胞主动把外膜PS转运到内膜。,流式细胞分析细胞凋亡,膜磷脂重分布的检测 在特定条件下，细胞发生凋亡时，这一不对称性被破坏，导致外膜持续出现PS。这一过程首先在受体激活的血小板和老化的红细胞中被发现。在受体激活或衰老时，细胞膜上PS转运活性受抑，使PS出现在血小板和红细胞外膜上。,流式细胞分析细胞凋亡,膜磷脂重分布的检测 Fadok等首先提出有核细胞凋亡时有PS外翻，与血小板和红细胞有相似之处。Fadok等的发现引发了凋亡中Annexin 作用的研究，这主要是由于在Ca2+存在时，Annexin 特异性的结合磷脂膜上的PS。因此， Annexin 能用于区别PS暴露和未暴露的血细胞和其他有核细胞。,流式细胞分析细胞凋亡,膜磷脂重分布的检测 由于Annexin 具有区别凋亡及坏死细胞的能力，使用结合FITC的Annexin 和PI，能区分活细胞、凋亡细胞和继发坏死细胞。PS外翻是绝大多数细胞发生凋亡的特异现象，而且不依赖于刺激因子。,流式细胞分析细胞凋亡,膜磷脂重分布的检测 Annexin -FITC与PS外翻的细胞迅速结合，无需长时间孵育和洗涤就可以用流式细胞仪分析。活细胞不被Annexin 和PI染色，膜未受损害凋亡细胞仅被Annexin 染色，继发的坏死细胞和晚期凋亡细胞被Annexin 和PI双染色。,流式细胞分析细胞凋亡,凋亡相关蛋白的检测 在细胞凋亡的研究中，要重视对凋亡相关蛋白的检测，它们在特定的信号传导通路中与启动凋亡的信号分子相互作用。从凋亡的开始到结束，许多信号传导通路都需要或受到特定的蛋白间相互作用的调控。,流式细胞分析细胞凋亡,凋亡相关蛋白的检测 我们现在所认识的P53、bcl-2、Fas等调控凋亡的基因蛋白，均有相应的商品化单克隆抗体产品，从而可以应用FCM快速、方便的检测，这也是目前流行的凋亡检测方法。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 随着FCM的发展和越来越多的荧光探针的出现，应用流式细胞仪检测凋亡细胞已成为细胞凋亡研究的常用方法。该方法可充分发挥FCM快速、灵敏、准确的特点，在完整细胞的基础上，直接分析DNA含量的变化，并可同时对细胞表型和调控蛋白进行测定。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 PI染液的配置（100ml）：PI5mg、RNase 2mg、1Triton X-100、生理盐水65ml、枸橼酸钠100mg，加蒸馏水至100ml，调pH至7.2-7.6,用棕色瓶分装，4避光保存。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 制备单细胞悬液，计数细胞，细胞为1×106个。假如适量生理盐水，1000rpm，离心5min，去上清，加入预冷的70乙醇，4过夜。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 离心除去固定液，适量生理盐水重悬细胞，采用筛网过滤一次，离心弃去上清，加入1mlPI染液，4避光孵育30min。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 PI用488nm的氩离子激光器激发，由630nm的带通滤光片接收，通过FSC/SSC散点图收集10000个细胞，采用设门技术排除粘连细胞和细胞碎片，分析PI荧光直方图上细胞各周期的百分率和凋亡细胞百分率。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 在FSC/SSC散点图上凋亡细胞与正常细胞相比，FSC较小。在PI荧光直方图上，凋亡细胞在G0/G1期前出现一亚二倍体峰。采用鸡红细胞作为内参对照，参入量为单细胞悬液的10，鸡红细胞的PI荧光强度为正常二倍体细胞的35。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 注意事项：单细胞悬液的细胞数量要充足，过少的细胞数会影响PI直方图上各时相的变异系数（CV），当G0/G1期的CV10时，结果的可信度下降。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 注意事项：70的乙醇固定效果最佳，甲醛或多聚甲醛均会影响亚二倍体的出现。 4或-20固定效果比37好。 固定过程中要充分混匀细胞，避免细胞团块形成。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 PI单染色法的最大优点在于获得凋亡细胞百分数的同时，可以与细胞周期中其他时相的细胞进行比较。方法简便、标本制备容易，检测费用低，是目前最经典也是最常用的细胞凋亡检测方法。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 但是PI单染色法无法确认是来自哪一时相的凋亡。对于S期和G2/M期的细胞发生凋亡时，凋亡峰有时与G1峰或S峰重叠，导致G1峰或S峰增宽，或无典型的亚二倍体峰出现。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 2 Annexin/PI双染色法 凋亡发生时，胞质膜的变化发生最早。在凋亡早期阶段，细胞内Ca2+持续、快速升高，致使大量Ca2+激活谷氨酰胺转移酶，谷氨酰胺转移酶的活化使胞质膜的不对称性丧失，导致膜内侧PS从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin探针所标记。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 2 Annexin/PI双染色法 Annexin为35-36KDCa2+依赖性磷脂结合蛋白，对PS有极强的亲和性，并可被FITC、PE等荧光物质标记。因此，采用Annexin这一敏感的探针可检测暴露于细胞膜表面的PS。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 2 Annexin/PI双染色法 但是，PS转移到胞膜外不是凋亡细胞所特有的，也可发生在细胞坏死中。二者的差别在于凋亡早期胞膜是完整的，而坏死在早期胞膜就被破坏了。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 2 Annexin/PI双染色法 PI对胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞拒染，而对晚期凋亡和坏死细胞可以染色。因此，Annexin结合PI进行双染色可用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 2 Annexin/PI双染色法 制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/ml，加入Annexin-FITC和PI，轻轻混匀，室温、避光孵育15min，1h内进行流式检测。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 2 Annexin/PI双染色法 激发光波长为488nm,用525nm的带通滤片检测FITC，用610nm的带通滤片检测PI。分别通过FITC和PI对数荧光直方图或散点图分析活细胞、凋亡细胞和坏死细胞百分率。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 2 Annexin/PI双染色法 对照设定：1单纯活细胞，不加Annexin和PI；2活细胞只加Annexin，不加PI；3活细胞只加PI，不加Annexin；4已知凋亡的细胞系作为阳性对照；已知未凋亡的细胞系作为阴性对照。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 2 Annexin/PI双染色法,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 2 Annexin/PI双染色法 凋亡时胞膜改变远远早于DNA改变，因此，Annexin/PI双染是检测早期凋亡的敏感方法。由于必须用活细胞，因此检测时间受到严格限制，而且对晚期凋亡细胞和坏死细胞无法准确区分。,流式细胞分析细胞凋亡,常用的细胞凋亡检测方法 凋亡相关蛋白的检测 Caspase-3、Fas、P53、bcl-2等。,