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BMPsⅡ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定.doc

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BMPsⅡ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定.doc

BMPsⅡ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定【关键词】BMPsⅡ型突变受体关键词BMPsⅡ型突变受体真核表达载体0引言骨形成蛋白(BMPs)不仅在骨,软骨及与骨骼有关的结缔组织的形成上有重要作用,而且起着十分重要的调控作用[1].与其他TGFβ超家族成员一样,BMPs在细胞表面与BMP的Ⅰ,Ⅱ型受体相互作用,Ⅰ型受体可以和过量的配体结合,而Ⅱ型受体与配体的结合则是特异性的[2].tBRK3k为BMPsⅡ型突变受体,其可以阻断BMP的信号转导,这样,BMP就无法发挥其骨诱导及在胚胎发育,器官形成及细胞分化中的作用.因此,为研究BMPs信号转导在组织发育和细胞分化中的作用,我们构建了BMPsⅠ型突变受体的真核表达载体,为此方面研究的开展奠定了基础.1材料和方法1.1材料pSP64TLtBRK3k质粒为含有BMPsⅡ型突变受体cDNA的克隆质粒,由日本的Nohno教授(Kawasaki医学院分子生物所)提供.真核表达载体pCDNA3(neo)购自本校生物化学教研室.限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自华美公司.DNA回收纯化试剂盒购自原平公司.1.2酶切鉴定及回收[3]将pSP64TLtBRK3k和pCDNA3(neo)用HindⅢ和XbaⅠ双酶切,经0.8琼脂糖凝胶电泳分别得到0.6,2.9和5.4kb的片段,用试剂盒回收纯化0.6kb和5.4kb的片段.1.3连接、转化和克隆筛选[3]取上述tBRK3k片段5μL和pCDNA3(neo)片段各2μL,加入T4DNA连接酶、缓冲液和无菌水各1μL,16℃连接过夜.制备大肠杆菌DH5α的感受态并转化.挑取单个菌落,液体LB培养基37℃振摇过夜,小提质粒,酶切鉴定筛选出阳性克隆,命名为pC4.2结果2.1pSP64TLtBRK3k和pCDNA3的酶切鉴定pSP64TLtBRK3k质粒经双酶切后,得到2.9kb和0.6kb两个片段pCDNA3(neo)经双酶切后,得到一个5.4kb的片段,符合二者的物理图谱(图1).图1略2.2pC4的酶切鉴定pC4经HindⅢ和XbaⅠ双酶切后,得到0.6kb和5.4kb两个片段,证明tBRK3k基因已成功连入到pCDNA(neo)中(图1).3讨论TGFβ超家族的成员都结合二种特异受体发挥作用,分别叫做Ⅰ型受体(约50~55KD)和Ⅱ型受体(约70~80KD)[4].和其他TGFβ超家族成员一样,BMPs在细胞表面与Ⅰ,Ⅱ型受体相互作用.Ⅰ型受体可以和过量的配体结合,而Ⅱ型受体与配体的结合则是特异性的.因此,为研究BMPs信号转导在机体发育中的作用,我们将突变型BMPsⅡ型受体(tBRK3k)定向克隆到pCDNA3(neo)表达载体中(图2).图2略pCDNA3(neo)可用于在哺乳动物细胞系表达外源基因,全长5.4kb.其表达系统构件包括CMV启动子,SV40复制起始点,SV40polyA,SV405端和3端剪切序列等,多聚接头有11个可供利用的单一酶切位点.pC4真核细胞表达载体可用于研究BMPs信号对间充质细胞分化的调控,对于研究和阐明BMPs在机体发育中的作用有重要意义.参考文献[1]WozneyJM,RosenV.Bonemorphogeneticproteinandmorphogeneticgenefamilyinboneformationandrepair[J].ClinOrthop,19983462637.[2]EstevezM,AttisanoL,WranaJLetal.Thedaf4geneencodsabonemorphogeneticproteinreceptorcontrollingc.elegansdauerlarvadevelopment[J].Nature,1993365644649.[3]J.萨姆布鲁克,EF.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南[M].第2版.北京科学技术出版社,19923456.[4]HeldinCH,MiyazonoK,TenDijkeP.TGFβsignallingfromcellmembranetonucleusthroughSMADproteins[J].Nature,1997390(4)465471.

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