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BMPsⅡ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定.doc

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BMPsⅡ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定.doc

BMPSⅡ型突变受体真核表达载体的构建与鉴定【关键词】BMPSⅡ型突变受体关键词BMPSⅡ型突变受体;真核表达载体0引言骨形成蛋白(BMPS)不仅在骨,软骨及与骨骼有关的结缔组织的形成上有重要作用,而且起着十分重要的调控作用[1]与其他TGFΒ超家族成员一样,BMPS在细胞表面与BMP的Ⅰ,Ⅱ型受体相互作用,Ⅰ型受体可以和过量的配体结合,而Ⅱ型受体与配体的结合则是特异性的[2]TBRK3K为BMPSⅡ型突变受体,其可以阻断BMP的信号转导,这样,BMP就无法发挥其骨诱导及在胚胎发育,器官形成及细胞分化中的作用因此,为研究BMPS信号转导在组织发育和细胞分化中的作用,我们构建了BMPSⅠ型突变受体的真核表达载体,为此方面研究的开展奠定了基础1材料和方法11材料PSP64TLTBRK3K质粒为含有BMPSⅡ型突变受体CDNA的克隆质粒,由日本的NOHNO教授(KAWASAKI医学院分子生物所)提供真核表达载体PCDNA3(NEO)购自本校生物化学教研室限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自华美公司DNA回收纯化试剂盒购自原平公司12酶切鉴定及回收[3]将PSP64TLTBRK3K和PCDNA3(NEO)用HINDⅢ和XBAⅠ双酶切,经08琼脂糖凝胶电泳分别得到06,29和54KB的片段,用试剂盒回收纯化06KB和54KB的片段13连接、转化和克隆筛选[3]取上述TBRK3K片段5ΜL和PCDNA3(NEO)片段各2ΜL,加入T4DNA连接酶、缓冲液和无菌水各1ΜL,16℃连接过夜制备大肠杆菌DH5Α的感受态并转化挑取单个菌落,液体LB培养基37℃振摇过夜,小提质粒,酶切鉴定筛选出阳性克隆,命名为PC42结果21PSP64TLTBRK3K和PCDNA3的酶切鉴定PSP64TLTBRK3K质粒经双酶切后,得到29KB和06KB两个片段;PCDNA3(NEO)经双酶切后,得到一个54KB的片段,符合二者的物理图谱(图1)图1略22PC4的酶切鉴定PC4经HINDⅢ和XBAⅠ双酶切后,得到06KB和54KB两个片段,证明TBRK3K基因已成功连入到PCDNA(NEO)中(图1)3讨论TGFΒ超家族的成员都结合二种特异受体发挥作用,分别叫做Ⅰ型受体(约50~55KD)和Ⅱ型受体(约70~80KD)[4]和其他TGFΒ超家族成员一样,BMPS在细胞表面与Ⅰ,Ⅱ型受体相互作用Ⅰ型受体可以和过量的配体结合,而Ⅱ型受体与配体的结合则是特异性的因此,为研究BMPS信号转导在机体发育中的作用,我们将突变型BMPSⅡ型受体(TBRK3K)定向克隆到PCDNA3(NEO)表达载体中(图2)图2略PCDNA3(NEO)可用于在哺乳动物细胞系表达外源基因,全长54KB其表达系统构件包括CMV启动子,SV40复制起始点,SV40POLYA,SV405’端和3’端剪切序列等,多聚接头有11个可供利用的单一酶切位点PC4真核细胞表达载体可用于研究BMPS信号对间充质细胞分化的调控,对于研究和阐明BMPS在机体发育中的作用有重要意义参考文献[1]WOZNEYJM,ROSENVBONEMORPHOGENETICPROTEINANDMORPHOGENETICGENEFAMILYINBONEFORMATIONANDREPAIR[J]CLINORTHOP,1998;3462637[2]ESTEVEZM,ATTISANOL,WRANAJLETALTHEDAF4GENEENCODSABONEMORPHOGENETICPROTEINRECEPTORCONTROLLINGCELEGANSDAUERLARVADEVELOPMENT[J]NATURE,1993;365644649[3]J萨姆布鲁克,EF弗里奇,T曼尼阿蒂斯分子克隆实验指南[M]第2版北京科学技术出版社,19923456[4]HELDINCH,MIYAZONOK,TENDIJKEPTGFΒSIGNALLINGFROMCELLMEMBRANETONUCLEUSTHROUGHSMADPROTEINS[J]NATURE,1997;390(4)465471

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