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Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定.doc

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Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定.doc

CDH1小干扰RNA载体的构建及鉴定【摘要】目的构建CDH1小干扰RNA载体,并将其转染至HELA细胞进行鉴定方法根据PENTRTM/H1/TO中间载体要求,设计CDH1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列,合成相应的DNA单链,退火后连接到PENTRTM/H1/TO线性载体,形成完整载体,进行测序鉴定分别将测序鉴定成功的CDH1小干扰RNA载体及对照载体采用脂质体法转染HELA细胞,转染后48H提取细胞总RNA及细胞总蛋白,采用实时定量PCR和WESTERNBLOT检测CDH1的表达结果经测序鉴定成功构建CDH1小干扰RNA载体和对照载体,分别命名为PENTR/SHCDH1和PENTR/SHCONTROL与未转染及转染PENTR/SHCONTROL的HELA细胞相比,转染PENTR/SHCDH1的HELA细胞CDH1表达降低(PLT;005)结论成功构建CDH1小干扰RNA载体,并能下调HELA细胞CDH1的表达【关键词】细胞周期细胞分裂RNA小干扰HELA细胞0引言CDH1是细胞周期后期分裂促进复合物(ANAPHASEPROMOTINGCOMPLEX,APC)的一个调节亚基,在细胞周期调控中发挥着重要作用近年来研究发现,CDH1APC在哺乳动物神经元中有大量表达,具有调节轴突生长和突触形成的功能,其在中枢神经系统疾病的发生发展中起重要作用[1]为了进一步探讨CDH1的功能,我们拟构建CDH1小干扰RNA载体,并将其转染至HELA细胞进行鉴定1材料和方法11材料PENTRTM/H1/TO载体试剂盒、TOP10感受态细菌和脂质体LIPOFECTAMINE2000均购自INVITROGEN公司(美国);DMEM/F12培养基、小牛血清购自GIBCO公司(美国);实时定量PCR试剂盒购自TAKARA公司(日本);LIGHTCYCLER实时荧光定量PCR仪为ROCHE公司(美国)12方法121载体的构建根据PENTRTM/H1/TO载体要求和参考文献[2]设计CDH1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列,合成相应的DNA单链,具体设计如下干扰序列TOPSTRAND5′CACCAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGCGAACTGACTGGGAGACTTCTCA3′,BOTTOMSTRAND5′AAAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGTTCGCTGACTGGGAGACTTCTCATT3′;对照序列TOPSTRAND5′CACCAAGAATGTCATCTACCACGGGCGAACCCGTGGTAGATGACATTC3′,BOTTOMSTRAND5′AAAAGAATGTCATCTACCACGGGTTCGCCCGTGGTAGATGACATTCTT3′将干扰序列和对照序列根据退火条件95℃退火4MIN,室温自然冷却5~10MIN得到退火产物,用T4DNA连接酶连接到PENTRTM/H1/TO线性载体上,16℃连接2H,连接产物转化TOP10感受态细菌,平铺入含卡那霉素(50MG/L)抗性平板中过夜培养,挑取单菌落扩增培养提取质粒后,由英骏生物技术有限公司进行DNA测序鉴定质粒分别命名为PENTR/SHCDH1和PENTR/SHCONTROL122细胞转染采用脂质体转染法将PENTR/SHCDH1和PENTR/SHCONTROL质粒分别转染HELA细胞,转染前1D将HELA细胞传代至六孔板,密度为90%左右,在2个EPPENDORF管中均加入250ΜLOPTIMEMⅠ培养基,然后分别加入10ΜL脂质体和4ΜG质粒混匀,室温下孵育5MIN轻柔混合两管液体,37℃孵育20MIN,加入HELA细胞中,将细胞置于37℃,50ML/LCO2培养箱中转染4H后换成含有100ML/L小牛血清的DMEM/F12培养基转染后48H,提取细胞总MRNA,逆转录成CDNA123实时定量PCR检测CDH1的表达以逆转录产物为模板进行实时定量PCR反应,以ΒACTIN基因为内参照,94℃变性5S,60℃退火及延伸20S,共反应40个循环,分析融解曲线CDH1基因上游引物为5′GCCAACTGGAGCGTGAACTT3′,下游引物为5′TTCAGCAGTGCGGAGTAGGC3′ΒACTIN基因上游引物为5′TGACAGGATGCAGAAGGAGA3′,下游引物为5′TAGAGCCACCAATCCACACA3′以△CT表示CDH1的表达,△CTCT(CDH1)CT(ΒACTIN),△CT值越高,CDH1的表达越低[3]124WESTERNBLOT检测CDH1的表达分别提取转PENTR/SHCDH1,PENTR/SHCONTROL及未转染的HELA细胞总蛋白,以ΒACTIN为内参照,取等量的蛋白质经聚丙稀酰胺凝胶电泳后,转至硝酸纤维素膜上,用50G/L脱脂奶粉封闭1H,加10MG/L抗CDH1MAB或抗ΒACTINMAB,室温孵育1H,漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1H,漂洗后二氨基联苯胺显色2~3MIN,水洗后照相统计学处理采用SPSS130统计学软件进行分析,计量资料以XS表示,采用方差分析,PLT;005为差异有统计学意义2结果21载体的构建经测序公司鉴定后构建的质粒PENTR/SHCDH1和PENTR/SHCONTROL,序列完全正确,无碱基突变22实时定量PCR检测HELA细胞CDH1的表达融解曲线分析表明设计的引物均得到了特异性的产物,与未转染及转染PENTR/SHCONTROL的HELA细胞相比,转染PENTR/SHCDH1的HELA细胞CDH1表达明显降低(PLT;005,表1)表1实时定量PCR检测HELA细胞中CDH1的表达(略)23WESTERNBLOT检测CDH1蛋白的表达与未转染及转染PENTR/SHCONTROL的HELA细胞相比,转染PENTR/SHCDH1的HELA细胞CDH1蛋白表达水平明显降低图13讨论细胞周期分裂后期促进复合物及其调节亚基CDH1不仅在增殖细胞中起重要作用,研究发现其在哺乳动物大脑皮质、海马、小脑等部位的终分化神经元核内有大量的表达,且具有泛素化周期蛋白B的活性,泛素化其他的底物,发挥其潜在作用[4]研究表明在不同类型的神经元,CDH1APC的表达降低引起的结果可能也不一样在胚胎鼠皮质神经元,降低CDH1APC的表达,周期蛋白B表达升高,使细胞异常地重新进入细胞周期,引起神经元的凋亡[5];而在新生鼠小脑颗粒神经元,抑制CDH1APC的表达及活性,发现神经元仍可存活,且轴突增长[1]RNA干扰技术是指生物体内导入短的双链RNADSRNA后使体内同源基因特异性的沉默SIRNA的来源有多种,如化学合成、体外转录合成及利用质粒或病毒载体表达SIRNA2002年,BRUMMELKAMP等[6]首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA(SMALLHAIRPINRNA,SHRNA)表达载体PSUPER,并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达在体内表达的SHRNA与DSRNA很接近,它包含了两个由一个小环序列分离的短反向重复序列,是由POLⅢ启动子控制的此方法可以长期抑制目的基因表达,因此,本课题选择载体构建的方法来实现基因下调实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差,该技术已被广泛应用于检测细胞MRNA表达量的变化、比较不同组织的MRNA表达差异等本研究我们通过脂质体法将构建成功的载体转染至HELA细胞中,结果显示转染PENTR/SHCDH1的HELA细胞CDH1表达明显降低,说明该载体具有基因下调作用【参考文献】[1]KONISHIY,STEGMULLERJ,MATSUDAT,ETALCDH1APCCONTROLSAXONALGROWTHANDPATTERNINGINTHEMAMMALIANBRAIN[J]SCIENCE,2004,303(5660)10261030[2]BASHIRT,DORRELLONV,AMADORV,ETALCONTROLOFTHESCFSKP2CKS1UBIQUITINLIGASEBYTHEAPC/CCDH1UBIQUITINLIGASE[J]NATURE,2004,428(6979)190193[3]LIVAKKJ,SCHMITTGENTDANALYSISOFRELATIVEGENEEXPRESSIONDATAUSINGREALTIMEQUANTITATIVEPCRANDTHE2DELTADELTACTMETHOD[J]METHODS,2001,254402408[4]GIEFFERSC,PETERSBH,KRAMERER,ETALEXPRESSIONOFTHECDH1ASSOCIATEDFORMOFTHEANAPHASEPROMOTINGCOMPLEXINPOSTMITOTICNEURONS[J]PROCNATLACADSCIUSA,1999,96(20)1131711322[5]ALMEIDAA,BOLANOSJP,MORENOS,ETALCDH1/HCT1APCISESSENTIALFORTHESURVIVALOFPOSTMITOTICNEURONS[J]NEUROSCIENCE,2005,25(36)81158121[6]BRUMMELKAMPTR,BERNARDSR,AGAMIRASYSTEMFORSTABLEEXPRESSIONOFSHORTINTERFERINGRNASINMAMMALIANCELLS[J]SCIENCE,2002,296(5567)550553

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