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Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定.doc

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Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定.doc

Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定【摘要】目的构建Cdh1小干扰RNA载体,并将其转染至Hela细胞进行鉴定.方法根据pENTRTM/H1/TO中间载体要求,设计Cdh1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列,合成相应的DNA单链,退火后连接到pENTRTM/H1/TO线性载体,形成完整载体,进行测序鉴定.分别将测序鉴定成功的Cdh1小干扰RNA载体及对照载体采用脂质体法转染Hela细胞,转染后48h提取细胞总RNA及细胞总蛋白,采用实时定量PCR和WesternBlot检测Cdh1的表达.结果经测序鉴定成功构建Cdh1小干扰RNA载体和对照载体,分别命名为pENTR/shCdh1和pENTR/shcontrol.与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比,转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1表达降低(Plt0.05).结论成功构建Cdh1小干扰RNA载体,并能下调Hela细胞Cdh1的表达.【关键词】细胞周期细胞分裂RNA小干扰Hela细胞0引言Cdh1是细胞周期后期分裂促进复合物(anaphasepromotingcomplex,APC)的一个调节亚基,在细胞周期调控中发挥着重要作用.近年来研究发现,Cdh1APC在哺乳动物神经元中有大量表达,具有调节轴突生长和突触形成的功能,其在中枢神经系统疾病的发生发展中起重要作用[1].为了进一步探讨Cdh1的功能,我们拟构建Cdh1小干扰RNA载体,并将其转染至Hela细胞进行鉴定.1材料和方法1.1材料pENTRTM/H1/TO载体试剂盒、TOP10感受态细菌和脂质体Lipofectamine2000均购自Invitrogen公司(美国)DMEM/F12培养基、小牛血清购自Gibco公司(美国)实时定量PCR试剂盒购自Takara公司(日本)LightCycler实时荧光定量PCR仪为Roche公司(美国).1.2方法1.2.1载体的构建根据pENTRTM/H1/TO载体要求和参考文献[2]设计Cdh1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列,合成相应的DNA单链,具体设计如下干扰序列topstrand5′CACCAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGCGAACTGACTGGGAGACTTCTCA3′,bottomstrand5′AAAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGTTCGCTGACTGGGAGACTTCTCATT3′对照序列topstrand5′CACCAAGAATGTCATCTACCACGGGCGAACCCGTGGTAGATGACATTC3′,bottomstrand5′AAAAGAATGTCATCTACCACGGGTTCGCCCGTGGTAGATGACATTCTT3′.将干扰序列和对照序列根据退火条件95℃退火4min,室温自然冷却5~10min得到退火产物,用T4DNA连接酶连接到pENTRTM/H1/TO线性载体上,16℃连接2h,连接产物转化TOP10感受态细菌,平铺入含卡那霉素(50mg/L)抗性平板中过夜培养,挑取单菌落扩增培养.提取质粒后,由英骏生物技术有限公司进行DNA测序鉴定.质粒分别命名为pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol.1.2.2细胞转染采用脂质体转染法将pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol质粒分别转染Hela细胞,转染前1d将Hela细胞传代至六孔板,密度为90%左右,在2个Eppendorf管中均加入250μLOPTIMEMⅠ培养基,然后分别加入10μL脂质体和4μg质粒混匀,室温下孵育5min.轻柔混合两管液体,37℃孵育20min,加入Hela细胞中,将细胞置于37℃,50mL/LCO2培养箱中转染4h后换成含有100mL/L小牛血清的DMEM/F12培养基.转染后48h,提取细胞总mRNA,逆转录成cDNA.1.2.3实时定量PCR检测Cdh1的表达以逆转录产物为模板进行实时定量PCR反应,以βactin基因为内参照,94℃变性5s,60℃退火及延伸20s,共反应40个循环,分析融解曲线.Cdh1基因上游引物为5′GCCAACTGGAGCGTGAACTT3′,下游引物为5′TTCAGCAGTGCGGAGTAGGC3′.βactin基因上游引物为5′TGACAGGATGCAGAAGGAGA3′,下游引物为5′TAGAGCCACCAATCCACACA3′.以△Ct表示Cdh1的表达,△CtCt(Cdh1)Ct(βactin),△Ct值越高,Cdh1的表达越低[3].1.2.4WesternBlot检测Cdh1的表达分别提取转pENTR/shcdh1,pENTR/shcontrol及未转染的Hela细胞总蛋白,以βactin为内参照,取等量的蛋白质经聚丙稀酰胺凝胶电泳后,转至硝酸纤维素膜上,用50g/L脱脂奶粉封闭1h,加10mg/L抗Cdh1mAb或抗βactinmAb,室温孵育1h,漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1h,漂洗后二氨基联苯胺显色2~3min,水洗后照相.统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以x±s表示,采用方差分析,Plt0.05为差异有统计学意义.2结果2.1载体的构建经测序公司鉴定后构建的质粒pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol,序列完全正确,无碱基突变.2.2实时定量PCR检测Hela细胞Cdh1的表达融解曲线分析表明设计的引物均得到了特异性的产物,与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比,转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1表达明显降低(Plt0.05,表1).表1实时定量PCR检测Hela细胞中Cdh1的表达(略)2.3WesternBlot检测Cdh1蛋白的表达与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比,转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1蛋白表达水平明显降低图1.3讨论细胞周期分裂后期促进复合物及其调节亚基Cdh1不仅在增殖细胞中起重要作用,研究发现其在哺乳动物大脑皮质、海马、小脑等部位的终分化神经元核内有大量的表达,且具有泛素化周期蛋白B的活性,泛素化其他的底物,发挥其潜在作用[4].研究表明在不同类型的神经元,Cdh1APC的表达降低引起的结果可能也不一样.在胚胎鼠皮质神经元,降低Cdh1APC的表达,周期蛋白B表达升高,使细胞异常地重新进入细胞周期,引起神经元的凋亡[5]而在新生鼠小脑颗粒神经元,抑制Cdh1APC的表达及活性,发现神经元仍可存活,且轴突增长[1].RNA干扰技术是指生物体内导入短的双链RNAdsRNA后使体内同源基因特异性的沉默.siRNA的来源有多种,如化学合成、体外转录合成及利用质粒或病毒载体表达siRNA.2002年,Brummelkamp等[6]首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA(smallhairpinRNA,shRNA)表达载体pSUPER,并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达.在体内表达的shRNA与dsRNA很接近,它包含了两个由一个小环序列分离的短反向重复序列,是由PolⅢ启动子控制的.此方法可以长期抑制目的基因表达,因此,本课题选择载体构建的方法来实现基因下调.实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差,该技术已被广泛应用于检测细胞mRNA表达量的变化、比较不同组织的mRNA表达差异等.本研究我们通过脂质体法将构建成功的载体转染至Hela细胞中,结果显示转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1表达明显降低,说明该载体具有基因下调作用.【参考文献】[1]KonishiY,StegmullerJ,MatsudaT,etal.Cdh1APCcontrolsaxonalgrowthandpatterninginthemammalianbrain[J].Science,2004,303(5660)10261030.[2]BashirT,DorrelloNV,AmadorV,etal.ControloftheSCFSkp2Cks1ubiquitinligasebytheAPC/CCdh1ubiquitinligase[J].Nature,2004,428(6979)190193.[3]LivakKJ,SchmittgenTD.AnalysisofrelativegeneexpressiondatausingrealtimequantitativePCRandthe2DeltaDeltaCTmethod[J].Methods,2001,254402408.[4]GieffersC,PetersBH,KramerER,etal.ExpressionoftheCDH1associatedformoftheanaphasepromotingcomplexinpostmitoticneurons[J].ProcNatlAcadSciUSA,1999,96(20)1131711322.[5]AlmeidaA,BolanosJ.P,MorenoS,etal.Cdh1/Hct1APCisessentialforthesurvivalofpostmitoticneurons[J].Neuroscience,2005,25(36)81158121.[6]BrummelkampTR,BernardsR,AgamiR.AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells[J].Science,2002,296(5567)550553.

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