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Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定.doc

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Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定.doc

CDH1小干扰RNA载体的构建及鉴定【摘要】目的构建CDH1小干扰RNA载体,并将其转染至HELA细胞进行鉴定方法根据PENTRTM/H1/TO中间载体要求,设计CDH1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列,合成相应的DNA单链,退火后连接到PENTRTM/H1/TO线性载体,形成完整载体,进行测序鉴定分别将测序鉴定成功的CDH1小干扰RNA载体及对照载体采用脂质体法转染HELA细胞,转染后48H提取细胞总RNA及细胞总蛋白,采用实时定量PCR和WESTERNBLOT检测CDH1的表达结果经测序鉴定成功构建CDH1小干扰RNA载体和对照载体,分别命名为PENTR/SHCDH1和PENTR/SHCONTROL与未转染及转染PENTR/SHCONTROL的HELA细胞相比,转染PENTR/SHCDH1的HELA细胞CDH1表达降低(PLT;005)结论成功构建CDH1小干扰RNA载体,并能下调HELA细胞CDH1的表达【关键词】细胞周期细胞分裂RNA小干扰HELA细胞0引言CDH1是细胞周期后期分裂促进复合物(ANAPHASEPROMOTINGCOMPLEX,APC)的一个调节亚基,在细胞周期调控中发挥着重要作用近年来研究发现,CDH1APC在哺乳动物神经元中有大量表达,具有调节轴突生长和突触形成的功能,其在中枢神经系统疾病的发生发展中起重要作用[1]为了进一步探讨CDH1的功能,我们拟构建CDH1小干扰RNA载体,并将其转染至HELA细胞进行鉴定1材料和方法11材料PENTRTM/H1/TO载体试剂盒、TOP10感受态细菌和脂质体LIPOFECTAMINE2000均购自INVITROGEN公司(美国);DMEM/F12培养基、小牛血清购自GIBCO公司(美国);实时定量PCR试剂盒购自TAKARA公司(日本);LIGHTCYCLER实时荧光定量PCR仪为ROCHE公司(美国)12方法121载体的构建根据PENTRTM/H1/TO载体要求和参考文献[2]设计CDH1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列,合成相应的DNA单链,具体设计如下干扰序列TOPSTRAND5′CACCAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGCGAACTGACTGGGAGACTTCTCA3′,BOTTOMSTRAND5′AAAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGTTCG

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