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fat1转基因小鼠的构建与鉴定.doc

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fat1转基因小鼠的构建与鉴定.doc

fat1转基因小鼠的构建与鉴定【摘要】目的构建和鉴定携带有外源fat1基因的转基因小鼠。方法将fat1基因的cDNA与动物表达载体pEFneo连接,构建pEFfat1重组质粒,酶切、测序鉴定正确后,以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中,并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠,通过PCR、Southernblot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果成功构建了pEFfat1重组质粒,将其显微注射到小鼠受精卵中,得到G0代小鼠,PCR、Southernblot杂交确立了4只整合有fat1基因的首建鼠。结论fat1基因可整合到小鼠体内,得到的转基因小鼠为研究fat1基因的生物学功能提供了动物模型。【关键词】小鼠转基因DNA重组fat1基因[ABSTRACT]ObjectiveToconstructandidentifythetransgenicmicewithextrinsicfat1gene.MethodsFat1cDNAandanimalexpressionvectorpEFneowereconjugatedtoconstructtherecombinantplasmidpEFfat1whichwasdigestedbyrestrictenzymeandsequencedcorrectly.TheobtainedlinearrecombinantplasmidpEFfat1wasmicroinjectedintothearsenoblastsofmousezygote,whichwasimplantedintotheuterustoproducetransgenicmice.PCRandSouthernblotwereperformedtoidentifythepositiveG0generationoffat1transgenicmice.ResultsRecombinantplasmidpEFfat1wassuccessfullyconstructedandfourG0micewithintegratedfat1genewereidentifiedviaPCRandSouthernblot.ConclusionFat1genecanbeintegratedintomousetoobtainthetransgenicmousethatprovidesananimalmodelforthestudyoffat1gene.[KEYWORDS]mice,transgenicDNA,recombinantfat1genefat1基因来源于小秀丽线虫,SPYCHALLA等[1]利用在阿拉伯芥(Arabidopsis)中进行异种表达的方法确认了fat1cDNA的序列。此cDNA的翻译产物是由402个氨基酸组成的n3多聚不饱和脂肪酸(PUFAs)脱氢酶,相对分子质量为4.64万,是氧离子依赖的含铁酶,属于跨膜蛋白超家族。此酶的功能是以16~20碳的n6PUFAs为底物进行脱氢反应,生成相应的n3PUFAs。体外实验表明,fat1cDNA的表达可促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,保护神经细胞,并可改变细胞膜n6/n3PUFAs的比例,降低来源于n6PUFAs的类花生酸的组成[2~7]。本文旨在构建和鉴定fat1转基因小鼠,从而为fat1基因在动物整体水平上的研究提供实验模型。1材料和方法1.1材料菌株XL1Blue及pEFneo质粒由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供。pcDNAfat1质粒内含fat1cDNA由本室保存。各种限制性内切酶、DNA分子质量标准λDNA/EcoRⅠHindⅢ及T4DNA连接酶等均购自Promega公司PCR引物由上海生工公司合成,DNA测序由北京三博远志生物公司完成。琼脂糖购自华美生物工程公司。DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司。其他试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1重组质粒pEFfat1的构建pcDNAfat1及表达载体pEFneo用EcoRⅠ/XbaⅠ进行双酶切,8g/L琼脂糖凝胶电泳,分别回收、纯化1.3kb片段和大片段。将1.3kb的目的片段和载体片段以摩尔比3∶1连接,转化感受态大肠杆菌XL1Blue后,用小量碱裂解法提取重组质粒。1.2.2重组质粒pEFfat1的鉴定据相应酶切图谱,上述提取的重组质粒分别用EcoRⅠ/XbaⅠ、BglⅡ、XhoⅠ进行酶切鉴定,将阳性重组子命名为pEFfat1。1.2.3重组质粒pEFfat1的序列测定将酶切鉴定为阳性重组子的pEFfat1送交北京三博远志生物公司进行全自动序列测定。1.2.4转基因小鼠的获得pEFfat1经SpeⅠ/BamHⅠ双酶切后,8g/L琼脂糖凝胶电泳分离回收5.5kb的大片段,纯化,最后溶解于微注射缓冲液(内含10mmol/LTrisHCl,pH8.0,0.1mmol/LEDTA)中,并准确调整DNA至3mg/L,以3pL的量注射到小鼠受精卵的雄原核中,并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中。小鼠为清洁级昆明白小鼠。1.2.5转基因小鼠的整合检测提取4~6周龄G0代转基因小鼠尾尖DNA,用PCR法测定G0代转基因动物的整合情况。所用引物为上游5′GTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCG3′下游5′GACGGAAAGCATCCACAGTTGG3′。扩增条件为94℃、3min,94℃、40s,55℃、40s,72℃、1min,72℃、8min,30个循环,扩增出的片段大小为440bp。经PCR检测阳性的小鼠再经Southernblot杂交做进一步确定。探针为pEFfat1,经SpeⅠ/BamHⅠ双酶切获得。1.2.6转基因小鼠的饲养和繁育小鼠的饲养条件为清洁级。将G0代转基因小鼠与正常小鼠交配产生G1代小鼠。根据遗传规律,鉴定至第5代时将得到稳定遗传的转基因小鼠。2结果2.1重组质粒pEFfat1的酶切鉴定及DNA序列测定重组质粒分别经EcoRⅠ/XbaⅠ、BgⅢ、XhoⅠ酶切鉴定,结果与原来载体和目的基因所带的限制性酶切位点相符。见图1。重组质粒pEFfat1的测序结果表明,载体与fat1cDNA接头部分及fat1cDNA本身序列均正确,无碱基突变。2.2转基因小鼠的获得将pEFfat1经SpeⅠ/BamHⅠ双酶切后回收纯化的片段显微注射到小鼠受精卵的雄原核中。共注射并移植受精卵738枚,存活的受精卵为486枚,将存活的受精卵移植到假母,成活的假母数为48只,最后生下42只G0代小鼠。2.3PCR检测阳性G0代小鼠以上述42只G0代鼠尾DNA为模板,作PCR检测,共检测出阳性小鼠11只。部分结果见图2。2.4Southernblot检测阳性G0代小鼠取PCR阳性样品作Southernblot杂交,结果显示有4只G0代小鼠基因组中整合有目的基因。见图3。将此阳性整合有外源基因的G0代转基因小鼠与正常小鼠交配产生G1代小鼠。3讨论许多研究发现,n6PUFAs可促进动物肿瘤的生长,而n3PUFAs则能抑制动物肿瘤的生长。临床研究显示,给乳癌和直肠癌病人的饮食中添加n3PUFAs,可减轻或抑制肿瘤的发展[8,9]。补充n3PUFAs对炎症和自身免疫病,如关节炎,具有治疗效果[10]。因此,n3PUFAs已日益成为研究的热点,人们更加注意到它作为药物和营养类化合物的价值。另一些研究表明,对于维持细胞的稳态和正常生长起关键作用的是n6/n3PUFAs的比例,而不是两者的绝对值[11]。仅仅通过饮食摄取足量的n3PUFAs的效率很低,很难满足机体的需要,这使得在哺乳动物体内迅速增加n3PUFAs非常困难。n3PUFAs或n6PUFAs的合成是分别通过对亚油酸(LA)或亚麻酸ALA进行一系列脱氢和延长来完成的。动物细胞缺乏脱氢酶活性,n6和n3PUFAs也不可相互转化。所以,ALA及对应的延长产物(n3PUFAs)就成为人类的必需脂肪酸。但是,一些植物和微生物具有能合成n3脂肪酸ALA的基因,如fat1。该基因来源于小秀丽线虫,mRNA全长1.4kb,其功能可将n6PUFAs脱氢转化成相应的n3PUFAs。当把该基因在植物阿拉伯芥中进行表达时,通过把n3双键引入到n6PUFAs碳氢链中,能催化n6PUFAs转化成为n3PUFAs[1]。以往的研究证明,利用腺病毒介导的fat1基因转移,可在体外培养的动物细胞中表达,且影响细胞的功能[2~7]。然而,fat1基因是否能在动物体内表达并发挥类似的功能,还有待于研究,为此需要建立一个fat1转基因动物模型。本文结果表明,fat1基因可导入动物体内,并得到了fat1基因G0代转基因小鼠,这为在动物整体水平上研究此基因功能奠定了一个实验基础。【参考文献】[1]SPYCHALLAJP,KINNEYAJ,BROWSEJ.Identificationofananimalomega3fattyaciddesaturasebyheterologousexpressioninArabidopsis[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997,94411421147.[2]GEYL,CHENZH,KANGZB,etal.EffectsofadenoviralgenetransferofC.elegansn3fattyaciddesaturaseonthelipidprofileandgrowthofhumanbreastcancercells[J].AnticancerRes,2002,222A537543.[3]KANGZB,GEYL,CHENZH,etal.AdenoviralgenetransferofCaenorhabditiselegansn3fattyaciddesaturaseoptimizesfattyacidcompositioninmammaliancells[J].PNAS,2001,98740504054.[4]GEYL,WANGXY,CHENZH,etal.GenetransferoftheCaenorhabditiselegansn3fattyaciddesaturaseinhibitsneuronalapoptosis[J].JNeurochemistry,2002,8213601366.[5]葛银林,陈志红,康兆彬,等.n3脂肪酸脱氢酶在人乳腺癌细胞内的表达和对其生长的影响[J].肿瘤防治杂志,2002,9(5特)112115.[6]葛银林,耿芳宋,张金玉,等.ω6脂肪酸脱氢酶基因在乳腺癌细胞内的表达和作用[J].中国生物化学与分子生物学报,2005,21(3)329333.[7]李馨,王秀丽,田润华,等.fat1基因对乳腺癌细胞的增殖抑制作用[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2005,12(1)3740.[8]ROSEDP.Dietaryfat,fattyacidsandbreastcancer[J].BreastCancer,1997,41716.[9]BARTSCHH,NAIRJ,OWENRW.Dietarypolyunsaturatedfattyacidsandcancersofthebreastandcolorectumemergingevidencefortheirroleasriskmodifiers[J].Carcinogenesis,1999,201222092218.[10]ROSEDP,CONNOLLYJM.Omega3fattyacidsascancerchemopreventiveagents[J].PharmacolTher,1999,833217244.[11]SIMOPOULOSAP.Theimportanceoftheratioofomega6/omega3essentialfattyacids[J].BiomedPharmacother,2002,568365379.

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