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fat1转基因小鼠的构建与鉴定.doc

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fat1转基因小鼠的构建与鉴定.doc

FAT1转基因小鼠的构建与鉴定【摘要】目的构建和鉴定携带有外源FAT1基因的转基因小鼠。方法将FAT1基因的CDNA与动物表达载体PEFNEO连接,构建PEFFAT1重组质粒,酶切、测序鉴定正确后,以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中,并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠,通过PCR、SOUTHERNBLOT杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果成功构建了PEFFAT1重组质粒,将其显微注射到小鼠受精卵中,得到G0代小鼠,PCR、SOUTHERNBLOT杂交确立了4只整合有FAT1基因的首建鼠。结论FAT1基因可整合到小鼠体内,得到的转基因小鼠为研究FAT1基因的生物学功能提供了动物模型。【关键词】小鼠转基因DNA重组FAT1基因[ABSTRACT]OBJECTIVETOCONSTRUCTANDIDENTIFYTHETRANSGENICMICEWITHEXTRINSICFAT1GENEMETHODSFAT1CDNAANDANIMALEXPRESSIONVECTORPEFNEOWERECONJUGATEDTOCONSTRUCTTHERECOMBINANTPLASMIDPEFFAT1WHICHWASDIGESTEDBYRESTRICTENZYMEANDSEQUENCEDCORRECTLYTHEOBTAINEDLINEARRECOMBINANTPLASMIDPEFFAT1WASMICROINJECTEDINTOTHEARSENOBLASTSOFMOUSEZYGOTE,WHICHWASIMPLANTEDINTOTHEUTERUSTOPRODUCETRANSGENICMICEPCRANDSOUTHERNBLOTWEREPERFORMEDTOIDENTIFYTHEPOSITIVEG0GENERATIONOFFAT1TRANSGENICMICERESULTSRECOMBINANTPLASMIDPEFFAT1WASSUCCESSFULLYCONSTRUCTEDANDFOURG0MICEWITHINTEGRATEDFAT1GENEWEREIDENTIFIEDVIAPCRANDSOUTHERNBLOTCONCLUSIONFAT1GENECANBEINTEGRATEDINTOMOUSETOOBTAINTHETRANSGENICMOUSETHATPROVIDESANANIMALMODELFORTHESTUDYOFFAT1GENE[KEYWORDS]MICE,TRANSGENIC;DNA,RECOMBINANT;FAT1GENEFAT1基因来源于小秀丽线虫,SPYCHALLA等[1]利用在阿拉伯芥(ARABIDOPSIS)中进行异种表达的方法确认了FAT1CDNA的序列。此CDNA的翻译产物是由402个氨基酸组成的N3多聚不饱和脂肪酸(PUFAS)脱氢酶,相对分子质量为464万,是氧离子依赖的含铁酶,属于跨膜蛋白超家族。此酶的功能是以16~20碳的N6PUFAS为底物进行脱氢反应,生成相应的N3PUFAS。体外实验表明,FAT1CDNA的表达可促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,保护神经细胞,并可改变细胞膜N6/N3PUFAS的比例,降低来源于N6PUFAS的类花生酸的组成[2~7]。本文旨在构建和鉴定FAT1转基因小鼠,从而为FAT1基因在动物整体水平上的研究提供实验模型。1材料和方法11材料菌株XL1BLUE及PEFNEO质粒由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供。PCDNAFAT1质粒内含FAT1CDNA由本室保存。各种限制性内切酶、DNA分子质量标准ΛDNA/ECORⅠHINDⅢ及T4DNA连接酶等均购自PROMEGA公司;PCR引物由上海生工公司合成,DNA测序由北京三博远志生物公司完成。琼脂糖购自华美生物工程公司。DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司。其他试剂均为国产分析纯。12方法121重组质粒PEFFAT1的构建PCDNAFAT1及表达载体PEFNEO用ECORⅠ/XBAⅠ进行双酶切,8G/L琼脂糖凝胶电泳,分别回收、纯化13KB片段和大片段。将13KB的目的片段和载体片段以摩尔比3∶1连接,转化感受态大肠杆菌XL1BLUE后,用小量碱裂解法提取重组质粒。122重组质粒PEFFAT1的鉴定据相应酶切图谱,上述提取的重组质粒分别用ECORⅠ/XBAⅠ、BGLⅡ、XHOⅠ进行酶切鉴定,将阳性重组子命名为PEFFAT1。123重组质粒PEFFAT1的序列测定将酶切鉴定为阳性重组子的PEFFAT1送交北京三博远志生物公司进行全自动序列测定。124转基因小鼠的获得PEFFAT1经SPEⅠ/BAMHⅠ双酶切后,8G/L琼脂糖凝胶电泳分离回收55KB的大片段,纯化,最后溶解于微注射缓冲液(内含10MMOL/LTRISHCL,PH80,01MMOL/LEDTA)中,并准确调整DNA至3MG/L,以3PL的量注射到小鼠受精卵的雄原核中,并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中。小鼠为清洁级昆明白小鼠。125转基因小鼠的整合检测提取4~6周龄G0代转基因小鼠尾尖DNA,用PCR法测定G0代转基因动物的整合情况。所用引物为上游5′GTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCG3′;下游5′GACGGAAAGCATCCACAGTTGG3′。扩增条件为94℃、3MIN,94℃、40S,55℃、40S,72℃、1MIN,72℃、8MIN,30个循环,扩增出的片段大小为440BP。经PCR检测阳性的小鼠再经SOUTHERNBLOT杂交做进一步确定。探针为PEFFAT1,经SPEⅠ/BAMHⅠ双酶切获得。126转基因小鼠的饲养和繁育小鼠的饲养条件为清洁级。将G0代转基因小鼠与正常小鼠交配产生G1代小鼠。根据遗传规律,鉴定至第5代时将得到稳定遗传的转基因小鼠。2结果21重组质粒PEFFAT1的酶切鉴定及DNA序列测定重组质粒分别经ECORⅠ/XBAⅠ、BGⅢ、XHOⅠ酶切鉴定,结果与原来载体和目的基因所带的限制性酶切位点相符。见图1。重组质粒PEFFAT1的测序结果表明,载体与FAT1CDNA接头部分及FAT1CDNA本身序列均正确,无碱基突变。22转基因小鼠的获得将PEFFAT1经SPEⅠ/BAMHⅠ双酶切后回收纯化的片段显微注射到小鼠受精卵的雄原核中。共注射并移植受精卵738枚,存活的受精卵为486枚,将存活的受精卵移植到假母,成活的假母数为48只,最后生下42只G0代小鼠。23PCR检测阳性G0代小鼠以上述42只G0代鼠尾DNA为模板,作PCR检测,共检测出阳性小鼠11只。部分结果见图2。24SOUTHERNBLOT检测阳性G0代小鼠取PCR阳性样品作SOUTHERNBLOT杂交,结果显示有4只G0代小鼠基因组中整合有目的基因。见图3。将此阳性整合有外源基因的G0代转基因小鼠与正常小鼠交配产生G1代小鼠。3讨论许多研究发现,N6PUFAS可促进动物肿瘤的生长,而N3PUFAS则能抑制动物肿瘤的生长。临床研究显示,给乳癌和直肠癌病人的饮食中添加N3PUFAS,可减轻或抑制肿瘤的发展[8,9]。补充N3PUFAS对炎症和自身免疫病,如关节炎,具有治疗效果[10]。因此,N3PUFAS已日益成为研究的热点,人们更加注意到它作为药物和营养类化合物的价值。另一些研究表明,对于维持细胞的稳态和正常生长起关键作用的是N6/N3PUFAS的比例,而不是两者的绝对值[11]。仅仅通过饮食摄取足量的N3PUFAS的效率很低,很难满足机体的需要,这使得在哺乳动物体内迅速增加N3PUFAS非常困难。N3PUFAS或N6PUFAS的合成是分别通过对亚油酸(LA)或亚麻酸ALA进行一系列脱氢和延长来完成的。动物细胞缺乏脱氢酶活性,N6和N3PUFAS也不可相互转化。所以,ALA及对应的延长产物(N3PUFAS)就成为人类的必需脂肪酸。但是,一些植物和微生物具有能合成N3脂肪酸ALA的基因,如FAT1。该基因来源于小秀丽线虫,MRNA全长14KB,其功能可将N6PUFAS脱氢转化成相应的N3PUFAS。当把该基因在植物阿拉伯芥中进行表达时,通过把N3双键引入到N6PUFAS碳氢链中,能催化N6PUFAS转化成为N3PUFAS[1]。以往的研究证明,利用腺病毒介导的FAT1基因转移,可在体外培养的动物细胞中表达,且影响细胞的功能[2~7]。然而,FAT1基因是否能在动物体内表达并发挥类似的功能,还有待于研究,为此需要建立一个FAT1转基因动物模型。本文结果表明,FAT1基因可导入动物体内,并得到了FAT1基因G0代转基因小鼠,这为在动物整体水平上研究此基因功能奠定了一个实验基础。【参考文献】[1]SPYCHALLAJP,KINNEYAJ,BROWSEJIDENTIFICATIONOFANANIMALOMEGA3FATTYACIDDESATURASEBYHETEROLOGOUSEXPRESSIONINARABIDOPSIS[J]PROCNATLACADSCIUSA,1997,94411421147[2]GEYL,CHENZH,KANGZB,ETALEFFECTSOFADENOVIRALGENETRANSFEROFCELEGANSN3FATTYACIDDESATURASEONTHELIPIDPROFILEANDGROWTHOFHUMANBREASTCANCERCELLS[J]ANTICANCERRES,2002,222A537543[3]KANGZB,GEYL,CHENZH,ETALADENOVIRALGENETRANSFEROFCAENORHABDITISELEGANSN3FATTYACIDDESATURASEOPTIMIZESFATTYACIDCOMPOSITIONINMAMMALIANCELLS[J]PNAS,2001,98740504054[4]GEYL,WANGXY,CHENZH,ETALGENETRANSFEROFTHECAENORHABDITISELEGANSN3FATTYACIDDESATURASEINHIBITSNEURONALAPOPTOSIS[J]JNEUROCHEMISTRY,2002,8213601366[5]葛银林,陈志红,康兆彬,等N3脂肪酸脱氢酶在人乳腺癌细胞内的表达和对其生长的影响[J]肿瘤防治杂志,2002,9(5特)112115[6]葛银林,耿芳宋,张金玉,等Ω6脂肪酸脱氢酶基因在乳腺癌细胞内的表达和作用[J]中国生物化学与分子生物学报,2005,21(3)329333[7]李馨,王秀丽,田润华,等FAT1基因对乳腺癌细胞的增殖抑制作用[J]中国肿瘤生物治疗杂志,2005,12(1)3740[8]ROSEDPDIETARYFAT,FATTYACIDSANDBREASTCANCER[J]BREASTCANCER,1997,41716[9]BARTSCHH,NAIRJ,OWENRWDIETARYPOLYUNSATURATEDFATTYACIDSANDCANCERSOFTHEBREASTANDCOLORECTUMEMERGINGEVIDENCEFORTHEIRROLEASRISKMODIFIERS[J]CARCINOGENESIS,1999,201222092218[10]ROSEDP,CONNOLLYJMOMEGA3FATTYACIDSASCANCERCHEMOPREVENTIVEAGENTS[J]PHARMACOLTHER,1999,833217244[11]SIMOPOULOSAPTHEIMPORTANCEOFTHERATIOOFOMEGA6/OMEGA3ESSENTIALFATTYACIDS[J]BIOMEDPHARMACOTHER,2002,568365379

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