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Genistein对K562细胞生长及CyclinD1基因和bcr┐abl融合基因表达的影响.doc

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Genistein对K562细胞生长及CyclinD1基因和bcr┐abl融合基因表达的影响.doc

Genistein对K562细胞生长及CyclinD1基因和bcr┐abl融合基因表达的影响作者王玮孙秉中于文彬冯琦【关键词】染料木黄酮关键词染料木黄酮CyclinD1基因CDK4蛋白bcrabl融合基因摘要目的研究Genistein抑制K562细胞生长的机制及对CyclinD1基因和bcrabl融合基因表达的影响.方法用RTPCR方法检测Genistein作用于K562细胞前后CyclinD1基因和bcrabl融合基因的mRNA表达变化,用免疫荧光、流式细胞仪和电镜检测CDK4蛋白的表达、细胞周期及凋亡.结果K562细胞中CyclinD1基因、bcrabl融合基因的mRNA和CDK4蛋白表达阳性,用Genistein与K562细胞共同孵育后,bcrabl融合基因的mRNA表达阴性,CyclinD1的mRNA和CDK4蛋白表达下降,细胞阻滞于G2/M期,K562细胞出现凋亡.结论bcrabl融合基因、CyclinD1基因和CDK4蛋白在K562细胞中高表达,Genistein能使K562细胞生长受抑,诱导其凋亡,抑制bcrabl基因的mRNA表达,并使CyclinD1基因的mRNA和CDK4蛋白表达下降,表明bcrabl融合基因、CyclinD1基因和CDK4对慢粒发展存在内在关系.KeywordsGenisteinCyclinD1geneCDK4proteinbcrablfusiongeneAbstractAIMToinvestigatethemechanismofhowGenisteinrestrainsthegrowthofK562cells,anditseffectontheexpressionofCyclinD1geneandbcrablfusiongene.METHODSGenisteinwasincubatedwithK562cells,themRNAofCyclinD1geneandbcrablfusiongenewereexaminedbyRTPCRandtheexpressionofCDK4protein,cellcycleandapoptosiswereexaminedbyimmunofluorescence,flowcytometryandelectronmicroscopeatthesametime.RESULTSTheexpressionofCyclinD1geneandbcrablfusiongenemRNAwaspositiveinK562cells.AfterK562cellswasincubatedwithGenistein,theexpressionofbcrablfusiongenemRNAandCDK4proteinwerenegative,mRNAofCyclinD1genedecreased.AndthecellwasblockedinG2/Mphase.Usingelectronmicroscopewecouldobservethecellsapoptosis.CONCLUSIONCyclinD1geneandbcrablfusiongenearehighlyexpressedinK562cells.ThegrowthofK562cellscouldberestrainedbyusingGenistein,whichinducesK562cellsapoptosis,represstheexpressionofbcrablfusiongene,andmakesCyclinD1andCDK4proteindecrease.ThisilluminatesthatCyclinD1gene,CDK4proteinandbcrablfusiongenemayhaverelationtothepathogenesisofchronicmyelogenousleukemia(CML).0引言肿瘤的发生、发展与细胞周期调控失调密切相关,细胞周期有关的原癌基因(如CyclinD1)与细胞增殖相关的癌基因(如bcrabl)在肿瘤发展上存在密切关系.已有文献[1,2]报道,用RTPCR方法检测到K562细胞中CyclinD1基因和bcrabl融合基因的mRNA高表达,我们进一步用酪氨酸激酶抑制剂Genistein作用于K562细胞后,观察CyclinD1基因、bcrabl融合基因的mRNA和CDK4蛋白表达的变化,同时观察Genistein对K562细胞生长、周期变化及凋亡的影响,探讨其抑制K562细胞生长的机制.1材料和方法1.1材料K562细胞株由西京医院血液科于文强博士惠赠.Genistein购于美国Sigma化学制剂公司,CDK4单抗购于美国SantaCruz化学制剂公司(由博士德公司提供),扩增CyclinD1基因和bcrabl融合基因的引物由大连宝生物Takara公司合成.1.2方法1.2.1细胞培养K562细胞用含100mL12539L1胎牛血清的RPMI1640培养液置37℃,50mL12539L1CO2孵箱中培养,实验取对数生长期细胞.绘制细胞生长曲线,每隔24h台盼蓝染色,计算细胞存活率.1.2.2RTPCR检测CyclinD1基因和bcrabl融合基因的mRNA表达将对数生长期细胞接种于6孔培养板中,细胞密度为310912539L1,加入40mg12539L1的Genistein,置37℃,50mL12539L1CO2孵箱中培养48h后,采用异硫氰酸胍苯酚氯仿法抽提总RNA,反转录成cDNA后进行PCR扩增.扩增CyclinD1基因的引物顺序上游引物5′CTGGCCATGAACTACCTGGA3′,下游引物5′GTCACACTTGATCACTCTGG3′,扩增483个bp[1]扩增bcrabl基因引物序列上游引物5′GATGCTGACCAACTCGTGTG3′,下游引物5′ACACCATTCCCCATTGTGAT3′,扩增376个bp[3],10g12539L1琼脂糖电泳检测扩增产物.1.2.3检测细胞周期、凋亡及CDK4单抗用流式细胞仪检测,取2106个细胞,700mL12539L1乙醇(20℃预冷)固定24h,离心,弃去乙醇,细胞重悬浮于PBS液中离心洗涤2次,去上清,细胞重悬浮于DNA染液中(含碘化丙锭),室温避光染色30min,取波长488nm蓝色激发光检测[4].参照文献[5]检测CDK4单抗.电镜观察K562细胞凋亡形态.2结果2.1Genistein抑制K562细胞株生长Genistein浓度40mg12539L1时即可明显抑制K562细胞的生长,50.0细胞生长被抑制时间约48h,作用72h内台盼蓝染色未见死细胞,细胞生长曲线如Fig1.2.2CyclinD1基因和bcr┐abl融合基因的mRNA表达降低K562细胞中CyclinD1基因和bcrabl融合基因的mRNA表达均为阳性.Genistein作用48h后,bcrabl融合基因的mRNA表达阴性,CyclinD1基因mRNA表达降低,电泳检测扩增产物,荧光亮度轻度减弱(Fig2,3).2.3Genistein阻断细胞生长于G2/M期及诱导K562细胞凋亡流式细胞仪检测K562细胞S期细胞占47.7,提示其DNA的合成、复制活跃,细胞增殖旺盛(Fig4)Genistein与K562细胞共同作用后,阻断K562细胞生长主要在G2/M期,使G2/M期细胞数大量增加,S期细胞明显减少(19.5),并在细胞周期图中的二倍体峰前可见一亚二倍体峰凋亡峰(apoptosispeak),提示其能抑制K562细胞生长,诱导其凋亡(Fig5).图1图3略2.4CDK4蛋白的表达下降K562细胞中CDK4蛋白表达阳性(平均荧光强度2.10),Genistein作用24h后,CDK4蛋白的表达水平明显下降(平均荧光强度0.807,Fig6,7).图4-图7略2.5电镜观察到K562细胞凋亡Genistein作用24h后,K562细胞变小,胞质轻度变性肿胀,核浓缩深染,核膜清楚,染色质聚集成团块状,靠近核膜边缘(Fig8).并可见早期凋亡小体,核碎裂呈团块状散布于胞质,被细胞膜所包绕,其中无各种细胞器.3讨论K562细胞为慢性粒细胞白血病(慢粒)急变细胞株,含有Ph染色体,产生bcrabl融合基因,编码p210BcrAbl蛋白,具有异常的高酪氨酸激酶活性,使细胞恶性增殖[6].近来研究发现慢粒发病和凋亡受抑[7]以及细胞周期调控失调[8]有密切联系,Genistein治疗慢粒的机制主要是阻断信号传导途径,促进细胞凋亡.其是否在基因水平及细胞周期调控角度发挥抗肿瘤作用,值得进一步研究.Carler等[9]研究发现Genistein能诱导慢粒患者骨髓中Bcr/Abl阳性集落进入凋亡,我们用Genistein作用于K562细胞后,出现细胞凋亡和G2/M期阻滞,说明Genistein除能抑制p210蛋白的酪氨酸激酶活性外,尚能从促进凋亡和调控细胞周期角度抑制K562细胞的生长.其诱导K562细胞凋亡的机制,主要是阻断了与bcrabl相关的信号传导途径(如Ras途径)后,抑制抗凋亡基因bcl2的表达,并促使凋亡基因fas等发挥作用[10].此外,细胞周期的改变,亦是促进细胞凋亡的因素,因G2/M期细胞明显增加,变异基因bcrabl被阻滞于G2/M期检测点,不能进入M期进行有丝分裂,使其在退出细胞周期过程中逐渐发生凋亡.图8略我们发现,Genistein能抑制bcrabl融合基因的mRNA表达.Carmelo等[2]的研究已排除Genistein通过抑制bcrabl的转录起作用的机制,故可能是抑制了bcrabl基因的复制.从细胞周期角度分析,Genistein作用K562细胞后使S期细胞数量明显减少,导致DNA的合成、复制减少,变异基因bcrabl的合成和复制相应减少,故bcrabl融合基因的表达降低.同时发现Genistein能使cyclinD1基因的mRNA表达下降.Cortez等[11]研究bcrabl融合基因的高酪氨酸激酶活性,可使造血细胞在失去生长因子的条件下激活CDK蛋白.本实验用Genistein抑制了K562细胞中的高酪氨酸激酶活性后,流式细胞仪检测证实能抑制CDK4蛋白的表达,而CyclinD1的表达依赖于CDK4蛋白的活化,因而CyclinD1基因的表达水平下降.在K562细胞中同时有CyclinD1基因和bcrabl融合基因的高表达,表明CyclinD1基因和bcrabl基因对慢粒发展可能有密切的联系.CyclinD1的过表达使细胞周期中G1/S期检测点功能低下,变异的bcrabl癌基因失去调控而进入S期复制,不能启动凋亡途径而凋亡,还能使细胞周期及癌基因的复制加速,故CyclinD1基因对bcrabl融合基因的表达起促进作用.但原癌基因CyclinD1单独作用不能使细胞发生恶性转化[12],必须通过癌基因bcrabl而发挥作用.参考文献[1]UchimaruK,TaniguchiT,YoshikawaM,AsanoS,ArnoldA,FujitaT,MotokuraT.DetectionofCyclinD1(bcl1,PRAD1)overexpressionbyasimplecompetitivereversetranscriptionpolymerasechainreactionassayint(11,14)(q13,q32)bearingBcellmalignanciesand/orMantlecelllymphoma[J].Blood,199789(3)965974.[2]CarmeloCS,GianpietroD,LinaM,EsterR,DanielaG,AntonioB,CamilloA,GabriellaS,BarbaraS,MariaTR,VittorioR.SelectionofmyeloidprogenitorslackingBCRABLmRNAinchronicmyelogenousleukemiapatientsafterinvitrotreatmentwiththetyrosinekinaseinhibitorGenistein[J].Blood,199688(89)30913100.[3]FengQ,SunBZ,ZhaoYT,SunK,YanZ,HanW,ZhangYQ.Studyonthecleavageabilityofthreerihozymesspecifictothedifferentsitesofbcrablfusiongene[J].DisiJunyiDaxueXuebao(JFourthMilMedUniv),199920(4)284287.[4]CaoRX,LiuZG,QuP,ZhangYF.Arapidwayofdeterminingactivityofcellsbyflowcytometry[J].DisiJunyiDaxueXuebao(JFourthMilMedUniv),200021(7)S198.[5]CaoYX,LiuZG,ZhongXN,DongJY.Indirectstainingofperipheralbloodsamplesforflowcytometry[J].DisiJunyiDaxueXuebao(JFourthMilMedUniv),200021(2)244246.[6]FengQ,SunBZ,ZhaoYT,SunK,YanZ,HanW,ZhangYQ.Constructionandidentificationofachronicmyeloidleukemiaspecificbcrabl3unitsribozyme[J].DisiJunyiDaxueXuebao(JFourthMilMedUniv),199819(4)471472.[7]ShangZC,SunBZ,FengQ,WangCH,XieXP,SongTT,ZhuHF.Thesynergisticeffectsofbcrablandcmycantisenseoligodeoxynucleotidesonchronicmyeloidleukemia[J].DisiJunyiDaxueXuebao(JFourthMilMedUniv),200021(3)275277.[8]BediA,BarberJP,BediGC,DeneyWS,SidranskyD,ValaMS,AkhtarAJ,HiltonJ,JonesRJ.BcrAblmediatedinhibitionofapoptosiswithdelayofG2/MtransitionafterDNAdamageAmechanismofresistancetomultipleanticanceragents[J].Blood,199586(1)11481158.[9]CarlerSC,DottiG,MangoniL,RegazziE,GarauD,BonatiA,AlmiciC,SammarelliG,SavoldoB,RizzoMT,RizzoliV.SelectionofmyeloidprogenitorslackingbcrablmRNAinchronicmyelogenousleukemiapatientsafterinvitrotreatmentwiththetyrosinekinaseinhibitorGenistein[J].Blood,199688(8)30913100.[10]RaitanoWhangYE,SawyersCI.Signaltransductionbywildtypeandleukemogenicablproteins[J].BiochimBiophysActa,19971333(3)F201F216.[11]CortezD,ReutherG,PendergastAM.Thebcrabltyrosinekinaseactivatemitogenizsignalingpathwaysandstimulates

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