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Genistein对K562细胞生长及CyclinD1基因和bcr┐abl融合基因表达的影响.doc

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Genistein对K562细胞生长及CyclinD1基因和bcr┐abl融合基因表达的影响.doc

GENISTEIN对K562细胞生长及CYCLIND1基因和BCR┐ABL融合基因表达的影响作者王玮孙秉中于文彬冯琦【关键词】染料木黄酮关键词染料木黄酮;CYCLIND1基因;CDK4蛋白;BCRABL融合基因摘要目的研究GENISTEIN抑制K562细胞生长的机制及对CYCLIND1基因和BCRABL融合基因表达的影响方法用RTPCR方法检测GENISTEIN作用于K562细胞前后CYCLIND1基因和BCRABL融合基因的MRNA表达变化,用免疫荧光、流式细胞仪和电镜检测CDK4蛋白的表达、细胞周期及凋亡结果K562细胞中CYCLIND1基因、BCRABL融合基因的MRNA和CDK4蛋白表达阳性,用GENISTEIN与K562细胞共同孵育后,BCRABL融合基因的MRNA表达阴性,CYCLIND1的MRNA和CDK4蛋白表达下降,细胞阻滞于G2/M期,K562细胞出现凋亡结论BCRABL融合基因、CYCLIND1基因和CDK4蛋白在K562细胞中高表达,GENISTEIN能使K562细胞生长受抑,诱导其凋亡,抑制BCRABL基因的MRNA表达,并使CYCLIND1基因的MRNA和CDK4蛋白表达下降,表明BCRABL融合基因、CYCLIND1基因和CDK4对慢粒发展存在内在关系KEYWORDSGENISTEIN;CYCLIND1GENE;CDK4PROTEIN;BCRABLFUSIONGENEABSTRACTAIMTOINVESTIGATETHEMECHANISMOFHOWGENISTEINRESTRAINSTHEGROWTHOFK562CELLS,ANDITSEFFECTONTHEEXPRESSIONOFCYCLIND1GENEANDBCRABLFUSIONGENEMETHODSGENISTEINWASINCUBATEDWITHK562CELLS,THEMRNAOFCYCLIND1GENEANDBCRABLFUSIONGENEWEREEXAMINEDBYRTPCRANDTHEEXPRESSIONOFCDK4PROTEIN,CELLCYCLEANDAPOPTOSISWEREEXAMINEDBYIMMUNOFLUORESCENCE,FLOWCYTOMETRYANDELECTRONMICROSCOPEATTHESAMETIMERESULTSTHEEXPRESSIONOFCYCLIND1GENEANDBCRABLFUSIONGENE’MRNAWASPOSITIVEINK562CELLSAFTERK562CELLSWASINCUBATEDWITHGENISTEIN,THEEXPRESSIONOFBCRABLFUSIONGENE’MRNAANDCDK4PROTEINWERENEGATIVE,MRNAOFCYCLIND1GENEDECREASEDANDTHECELLWASBLOCKEDING2/MPHASEUSINGELECTRONMICROSCOPEWECOULDOBSERVETHECELL’SAPOPTOSISCONCLUSIONCYCLIND1GENEANDBCRABLFUSIONGENEAREHIGHLYEXPRESSEDINK562CELLSTHEGROWTHOFK562CELLSCOULDBERESTRAINEDBYUSINGGENISTEIN,WHICHINDUCESK562CELL’SAPOPTOSIS,REPRESSTHEEXPRESSIONOFBCRABLFUSIONGENE,ANDMAKESCYCLIND1ANDCDK4PROTEINDECREASETHISILLUMINATESTHATCYCLIND1GENE,CDK4PROTEINANDBCRABLFUSIONGENEMAYHAVERELATIONTOTHEPATHOGENESISOFCHRONICMYELOGENOUSLEUKEMIA(CML)0引言肿瘤的发生、发展与细胞周期调控失调密切相关,细胞周期有关的原癌基因(如CYCLIND1)与细胞增殖相关的癌基因(如BCRABL)在肿瘤发展上存在密切关系已有文献[1,2]报道,用RTPCR方法检测到K562细胞中CYCLIND1基因和BCRABL融合基因的MRNA高表达,我们进一步用酪氨酸激酶抑制剂GENISTEIN作用于K562细胞后,观察CYCLIND1基因、BCRABL融合基因的MRNA和CDK4蛋白表达的变化,同时观察GENISTEIN对K562细胞生长、周期变化及凋亡的影响,探讨其抑制K562细胞生长的机制1材料和方法11材料K562细胞株由西京医院血液科于文强博士惠赠GENISTEIN购于美国SIGMA化学制剂公司,CDK4单抗购于美国SANTACRUZ化学制剂公司(由博士德公司提供),扩增CYCLIND1基因和BCRABL融合基因的引物由大连宝生物TAKARA公司合成12方法121细胞培养K562细胞用含100ML12539;L1胎牛血清的RPMI1640培养液置37℃,50ML12539;L1CO2孵箱中培养,实验取对数生长期细胞绘制细胞生长曲线,每隔24H台盼蓝染色,计算细胞存活率122RTPCR检测CYCLIND1基因和BCRABL融合基因的MRNA表达将对数生长期细胞接种于6孔培养板中,细胞密度为310912539;L1,加入40MG12539;L1的GENISTEIN,置37℃,50ML12539;L1CO2孵箱中培养48H后,采用异硫氰酸胍苯酚氯仿法抽提总RNA,反转录成CDNA后进行PCR扩增扩增CYCLIND1基因的引物顺序上游引物5′CTGGCCATGAACTACCTGGA3′,下游引物5′GTCACACTTGATCACTCTGG3′,扩增483个BP[1];扩增BCRABL基因引物序列上游引物5′GATGCTGACCAACTCGTGTG3′,下游引物5′ACACCATTCCCCATTGTGAT3′,扩增376个BP[3],10G12539;L1琼脂糖电泳检测扩增产物123检测细胞周期、凋亡及CDK4单抗用流式细胞仪检测,取2106个细胞,700ML12539;L1乙醇(20℃预冷)固定24H,离心,弃去乙醇,细胞重悬浮于PBS液中离心洗涤2次,去上清,细胞重悬浮于DNA染液中(含碘化丙锭),室温避光染色30MIN,取波长488NM蓝色激发光检测[4]参照文献[5]检测CDK4单抗电镜观察K562细胞凋亡形态2结果21GENISTEIN抑制K562细胞株生长GENISTEIN浓度40MG12539;L1时即可明显抑制K562细胞的生长,500细胞生长被抑制时间约48H,作用72H内台盼蓝染色未见死细胞,细胞生长曲线如FIG122CYCLIND1基因和BCR┐ABL融合基因的MRNA表达降低K562细胞中CYCLIND1基因和BCRABL融合基因的MRNA表达均为阳性GENISTEIN作用48H后,BCRABL融合基因的MRNA表达阴性,CYCLIND1基因MRNA表达降低,电泳检测扩增产物,荧光亮度轻度减弱(FIG2,3)23GENISTEIN阻断细胞生长于G2/M期及诱导K562细胞凋亡流式细胞仪检测K562细胞S期细胞占477,提示其DNA的合成、复制活跃,细胞增殖旺盛(FIG4);GENISTEIN与K562细胞共同作用后,阻断K562细胞生长主要在G2/M期,使G2/M期细胞数大量增加,S期细胞明显减少(195),并在细胞周期图中的二倍体峰前可见一亚二倍体峰凋亡峰(APOPTOSISPEAK),提示其能抑制K562细胞生长,诱导其凋亡(FIG5)图1图3略24CDK4蛋白的表达下降K562细胞中CDK4蛋白表达阳性(平均荧光强度210),GENISTEIN作用24H后,CDK4蛋白的表达水平明显下降(平均荧光强度0807,FIG6,7)图4-图7略25电镜观察到K562细胞凋亡GENISTEIN作用24H后,K562细胞变小,胞质轻度变性肿胀,核浓缩深染,核膜清楚,染色质聚集成团块状,靠近核膜边缘(FIG8)并可见早期凋亡小体,核碎裂呈团块状散布于胞质,被细胞膜所包绕,其中无各种细胞器3讨论K562细胞为慢性粒细胞白血病(慢粒)急变细胞株,含有PH染色体,产生BCRABL融合基因,编码P210BCRABL蛋白,具有异常的高酪氨酸激酶活性,使细胞恶性增殖[6]近来研究发现慢粒发病和凋亡受抑[7]以及细胞周期调控失调[8]有密切联系,GENISTEIN治疗慢粒的机制主要是阻断信号传导途径,促进细胞凋亡其是否在基因水平及细胞周期调控角度发挥抗肿瘤作用,值得进一步研究CARLER等[9]研究发现GENISTEIN能诱导慢粒患者骨髓中BCR/ABL阳性集落进入凋亡,我们用GENISTEIN作用于K562细胞后,出现细胞凋亡和G2/M期阻滞,说明GENISTEIN除能抑制P210蛋白的酪氨酸激酶活性外,尚能从促进凋亡和调控细胞周期角度抑制K562细胞的生长其诱导K562细胞凋亡的机制,主要是阻断了与BCRABL相关的信号传导途径(如RAS途径)后,抑制抗凋亡基因BCL2的表达,并促使凋亡基因FAS等发挥作用[10]此外,细胞周期的改变,亦是促进细胞凋亡的因素,因G2/M期细胞明显增加,变异基因BCRABL被阻滞于G2/M期检测点,不能进入M期进行有丝分裂,使其在退出细胞周期过程中逐渐发生凋亡图8略我们发现,GENISTEIN能抑制BCRABL融合基因的MRNA表达CARMELO等[2]的研究已排除GENISTEIN通过抑制BCRABL的转录起作用的机制,故可能是抑制了BCRABL基因的复制从细胞周期角度分析,GENISTEIN作用K562细胞后使S期细胞数量明显减少,导致DNA的合成、复制减少,变异基因BCRABL的合成和复制相应减少,故BCRABL融合基因的表达降低同时发现GENISTEIN能使CYCLIND1基因的MRNA表达下降CORTEZ等[11]研究BCRABL融合基因的高酪氨酸激酶活性,可使造血细胞在失去生长因子的条件下激活CDK蛋白本实验用GENISTEIN抑制了K562细胞中的高酪氨酸激酶活性后,流式细胞仪检测证实能抑制CDK4蛋白的表达,而CYCLIND1的表达依赖于CDK4蛋白的活化,因而CYCLIND1基因的表达水平下降在K562细胞中同时有CYCLIND1基因和BCRABL融合基因的高表达,表明CYCLIND1基因和BCRABL基因对慢粒发展可能有密切的联系CYCLIND1的过表达使细胞周期中G1/S期检测点功能低下,变异的BCRABL癌基因失去调控而进入S期复制,不能启动凋亡途径而凋亡,还能使细胞周期及癌基因的复制加速,故CYCLIND1基因对BCRABL融合基因的表达起促进作用但原癌基因CYCLIND1单独作用不能使细胞发生恶性转化[12],必须通过癌基因BCRABL而发挥作用参考文献[1]UCHIMARUK,TANIGUCHIT,YOSHIKAWAM,ASANOS,ARNOLDA,FUJITAT,MOTOKURATDETECTIONOFCYCLIND1(BCL1,PRAD1)OVEREXPRESSIONBYASIMPLECOMPETITIVEREVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTIONASSAYINT(11,14)(Q13,Q32)BEARINGBCELLMALIGNANCIESAND/ORMANTLECELLLYMPHOMA[J]BLOOD,1997;89(3)965974[2]CARMELOCS,GIANPIETROD,LINAM,ESTERR,DANIELAG,ANTONIOB,CAMILLOA,GABRIELLAS,BARBARAS,MARIATR,VITTORIORSELECTIONOFMYELOIDPROGENITORSLACKINGBCRABLMRNAINCHRONICMYELOGENOUSLEUKEMIAPATIENTSAFTERINVITROTREATMENTWITHTHETYROSINEKINASEINHIBITORGENISTEIN[J]BLOOD,1996;88(89)30913100[3]FENGQ,SUNBZ,ZHAOYT,SUNK,YANZ,HANW,ZHANGYQSTUDYONTHECLEAVAGEABILITYOFTHREERIHOZYMESSPECIFICTOTHEDIFFERENTSITESOFBCRABLFUSIONGENE[J]DISIJUNYIDAXUEXUEBAO(JFOURTHMILMEDUNIV),1999;20(4)284287[4]CAORX,LIUZG,QUP,ZHANGYFARAPIDWAYOFDETERMININGACTIVITYOFCELLSBYFLOWCYTOMETRY[J]DISIJUNYIDAXUEXUEBAO(JFOURTHMILMEDUNIV),2000;21(7)S198[5]CAOYX,LIUZG,ZHONGXN,DONGJYINDIRECTSTAININGOFPERIPHERALBLOODSAMPLESFORFLOWCYTOMETRY[J]DISIJUNYIDAXUEXUEBAO(JFOURTHMILMEDUNIV),2000;21(2)244246[6]FENGQ,SUNBZ,ZHAOYT,SUNK,YANZ,HANW,ZHANGYQCONSTRUCTIONANDIDENTIFICATIONOFACHRONICMYELOIDLEUKEMIASPECIFICBCRABL3UNITSRIBOZYME[J]DISIJUNYIDAXUEXUEBAO(JFOURTHMILMEDUNIV),1998;19(4)471472[7]SHANGZC,SUNBZ,FENGQ,WANGCH,XIEXP,SONGTT,ZHUHFTHESYNERGISTICEFFECTSOFBCRABLANDCMYCANTISENSEOLIGODEOXYNUCLEOTIDESONCHRONICMYELOIDLEUKEMIA[J]DISIJUNYIDAXUEXUEBAO(JFOURTHMILMEDUNIV),2000;21(3)275277[8]BEDIA,BARBERJP,BEDIGC,DENEYWS,SIDRANSKYD,VALAMS,AKHTARAJ,HILTONJ,JONESRJBCRABLMEDIATEDINHIBITIONOFAPOPTOSISWITHDELAYOFG2/MTRANSITIONAFTERDNADAMAGEAMECHANISMOFRESISTANCETOMULTIPLEANTICANCERAGENTS[J]BLOOD,1995;86(1)11481158[9]CARLERSC,DOTTIG,MANGONIL,REGAZZIE,GARAUD,BONATIA,ALMICIC,SAMMARELLIG,SAVOLDOB,RIZZOMT,RIZZOLIVSELECTIONOFMYELOIDPROGENITORSLACKINGBCRABLMRNAINCHRONICMYELOGENOUSLEUKEMIAPATIENTSAFTERINVITROTREATMENTWITHTHETYROSINEKINASEINHIBITORGENISTEIN[J]BLOOD,1996;88(8)30913100[10]RAITANOWHANGYE,SAWYERSCISIGNALTRANSDUCTIONBYWILDTYPEANDLEUKEMOGENICABLPROTEINS[J]BIOCHIMBIOPHYSACTA,1997;1333(3)F201F216[11]CORTEZD,REUTHERG,PENDERGASTAMTHEBCRABLTYROSINEKINASEACTIVATEMITOGENIZSIGNALINGPATHWAYSANDSTIMULATES

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