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Pax-8基因在心脏发育中蛋白表达下调.doc

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Pax-8基因在心脏发育中蛋白表达下调.doc

Pax8基因在心脏发育中蛋白表达下调作者倪秋明,章佳颖,来丹丹,褚茂平,王赛斌,黄晓燕,张怀勤,杨德业【摘要】目的观察Pax8基因在ALK3基因敲除小鼠心脏中的蛋白表达情况,探讨Pax8基因在心脏发育中的作用。方法基因芯片microarray和定量逆转录聚合酶链反应测定ALK3基因的下游基因,免疫组化法检测13.5d小鼠胚胎心脏特异性ALK3基因敲除小鼠胚胎中Pax8蛋白的表达,连续病理切片及HE染色观察刚出生的Pax8基因敲除小鼠的心脏形态。结果在心脏特异的ALK3基因敲除小鼠中,转录因子Pax8基因mRNA的表达水平上被下调7.1倍。免疫组化结果显示13.5d小鼠胚胎心脏特异性ALK3基因敲除的纯合子小鼠Pax8基因在蛋白水平与杂合子相比也明显下调。Pax8基因敲除小鼠纯合子有明显的室间隔和左心室肥厚,心脏呈球形。结论Pax8基因是ALK3基因的下游基因,与心脏发育有密切关系。【关键词】Pax8基因室间隔缺损免疫组化蛋白表达AbstractObjectiveToinvestigatethelevelofPax8proteinexpressionintheconditionalALK3kockoutmiceheartandstudytheroleofPax8geneinthecardiacdevelopment.MethodsThemicroarrayandrealtimequantitativeRTPCRwereusedtoinvestigatethedownstreamgenesofALK3.ImmunohistochemicaltechnologywasusedtodetectthelevelofPax8proteinexpressioninthe13.5dheartderivedfromaMHCCre/,ALK3F/andaMHCCre/,ALK3F/mice.TostudythecontributionofPax8geneinthecardiacdevelopment,theheartderivedfrompax8kockoutmicewasoverviewedusingconsecutivepathologicalsectionandHEstainingmethod.ResultsThelevelofPax8mRNAexpressionwasdownregulated7.1foldintheembryonicheart11.5daysofaMHCCre/,ALK3F/.ThelevelofPax8proteinexpressionwasalsoremarkablydownregulatedintheembryonicheart13.5daysofaMHCCre/,ALK3F/.Theheartofpax8KO/micebecamespheroidal,theleftventricleenlarged,leftventricularwallandinterventricularseptumthickened,papillarymusclesintheleftventricleenlarged.ConclusionPax8geneisthecardiacspecificALK3downstreamgene.Pax8mayplayimportantrolesinthecardiacdevelopment.KeywordsPax8geneventricularseptaldefectimmunohistochemistryproteinexpression先天性室间隔缺损的发病机制尚不十分清楚。近年来,美国Schneider教授使用aMHCCreloxP系统1心脏特异性敲除系统对心脏ALK3基因进行特异性地敲除,ALK3基因敲除的纯合子小鼠死于胚胎中期,并有室间隔缺损、心内膜垫和肌小梁发育不良2。然而,ALK3基因是与心脏发育有关的比较上游的基因。为了研究ALK3下游的并有心脏特异性的基因,在ALK3基因敲除和Pax8基因敲除小鼠模型上,观察Pax8基因在心脏中的蛋白表达情况,以探讨Pax8基因在心脏发育中的作用。1材料和方法1.1动物20只aMHCCre/、ALK3/(aMHC为启动子的Cre重组酶转基因杂合子,ALK3系统基因敲除的杂合子小鼠)和20只ALK3F/F(在ALK3基因第2个外显子两端插入loxP序列的小鼠)的C57小鼠由美国Schneider教授提供交配,可得到在心脏纯合子ALK3基因敲除aMHCCre/、ALK3F/的小鼠胚胎和杂合子ALK3基因敲除aMHCCre/、ALK3F/+的胚胎。Pax8基因敲除的纯合子小鼠Pax8KO/和Pax8基因敲除的杂合子小鼠Pax8KO/由德国Gruss和Mansouri教授惠赠。1.2总RNA的提取首先收集试验组和对照组的11.5d小鼠的胚胎心脏,然后用总RNA试剂盒(美国QIAGEN公司生产)提取和纯化总RNA。1.3基因芯片3德国生产的25000个小鼠基因的基因芯片被用于比较两组11.5d小鼠胚胎心脏总RNA。试验组的总RNA来自aMHCCre/、ALK3F/的11.5d小鼠胚胎心脏,对照组的总RNA来自aMHCCre/、ALK3F/的11.5d小鼠胚胎心脏。1.4定量逆转录聚合酶链反应4TaqMan一步法聚合酶链反应试剂盒美国PerkinElmer公司生产被用于定量RTPCR。每个PCR反应孔使用100ng的总RNA。试验组的RNA来自aMHCCre/、ALK3F/的11.5d小鼠胚胎心脏,对照组的RNA来自aMHCCre/、ALK3F/的11.5d小鼠胚胎心脏。cDNA合成的条件是48℃、30min。cDNA经过40个PCR周期被扩增。在PCR扩增前首先用95℃、10min使cDNA变性。每个PCR周期由95℃、15s(变性)加上60℃、1s(退火延伸)。每种RNA同时做3个条件完全相同的PCR反应孔。所有PCR有效性在95以上。ABIPRISM7700序列检测仪美国PerkinElmer公司生产被用于定量RTPCR的检测。转录因子Pax8的荧光素探针序列是6FAMTGTCCCCAGTGTCAGCTCCATCAACATAMRA。Pax8的正向引物序列是5CAGAAGGCGTTTGTGACAATGA3。Pax8的逆向引物序列是5GCACTTTGGTCCGGATGATT3。定量RTPCR内部对照基因36B4的荧光素探针序列是6FAMCCAGGCTTTGGGCATCACCACGTAMRA。36B4的正向引物序列是5GGACCCGAGAAGACCTCCTT3。36B4逆向引物序列是5TCAATGGTGCCTCTGGAGATT3。1.5免疫组化染色试验分A、B、C、D四组,A组试验组为aMHCCre/、ALK3F/纯合子小鼠胚胎6只,B组对照组为aMHCCre/、ALK3F/杂合子的小鼠胚胎6只,C组阴性对照组为Pax8KO/纯合子6只,D组阳性对照组为刚出生正常C57小鼠6只。取13.5daMHCCre/、ALK3F/纯合子和aMHCCre/、ALK3F/杂合子以及13.5d的Pax8KO/(纯合子)的小鼠胚胎心脏,刚出生C57小鼠取甲状腺组织。免疫组化采用SABC法,具体步骤参照免疫组化试剂盒(Proteintech生物技术有限公司生产)说明书。免疫组化染色图片每张切片光镜下放大400倍,随机抽取3~5个视野,用Advancedspot拍照系统进行拍照保存。应用IPP分析软件测定图片的累计光密度值(OD值)。1.6HE染色试验组为19.5d刚出生Pax8KO/纯合子的小鼠,对照组为19.5d刚出生Pax8KO/杂合子的小鼠,按常规做四腔心切片,切片厚度约3μm,切片用HE法染色来观察心脏大体形态。HE染色图片,在光镜下放大20倍,直接观察,拍照。1.7统计学处理方法采用SPSS13.0统计软件,多组之间均数的两两比较采用SNKq检验。2结果2.1心脏特异ALK3基因敲除小鼠的获得雌的αMHCCre/、ALK3/和雄的ALK3F/F在ALK3基因第二外显子两边插入LoxP的片段交配可获得αMHCCre/、ALK3F/纯合子和αMHCCre/、ALK3F/杂合子的小鼠胚胎。2.2Pax8基因敲除小鼠的获得雌的Pax8KO/和雄的Pax8KO/交配可获得Pax8KO/纯合子和Pax8KO/杂合子。2.3用基因芯片的方法获得的ALK3下游的可能基因将25000个基因在试验组和对照组中的mRNA表达水平进行比较,增加或减少两倍以上为阳性。Pax8及Hox3.5等12个基因在aMHCCre/、ALK3F/小鼠胚胎心脏中的表达下调,见表1。Ras相关蛋白Rab5b及EPS8蛋白等16个基因在aMHCCre/、ALK3F/小鼠胚胎心脏中的表达是上调的,见表2。2.4定量RTPCR结果转录因子Pax8基因在αMHCCre/、ALK3F/组小鼠比αMHCCre/、ALK3F/组小鼠表达水平低7.1倍(Plt0.01)。而作为定量RTPCR内部对照的36B4基因的表达水平在两组间的差异无显著性。见图1。2.5免疫组化染色结果2.5.1试验组aMHCCre/、ALK3F/纯合子心脏中Pax8阳性染色比较少,每个视野下只有少数细胞核呈阳性,被染成棕黄色,而αMHCCre/、ALK3F/杂合子心脏对照组每个视野下可见大量阳性细胞,细胞核被染成棕黄色。C57小鼠甲状腺阳性对照组也可见大量阳性细胞表达,而Pax8KO/纯合子小鼠阴性对照组心脏未见DAB染色及阳性细胞表达(见图2)。2.5.2图片分析及统计学处理结果四组Pax8免疫组化染色的图像分析数据及其统计分析结果见表3。2.6HE染色结果Pax8KO/纯合子小鼠,四腔心切片,HE染色,有明显左室肥大及室间隔肥厚,对照组Pax8KO/杂合子小鼠心脏形态未见明显异常(见图3)。3讨论Pax基因是编码转录因子的发育控制基因的超家族,它包括9个成员,即Pax1~956。Pax8基因是Pax基因家族的一个成员,定位于人类染色体2q121478,在小鼠定位于染色体2,人和小鼠的Pax8基因的保守区域结构特征相似,都编码128个氨基酸的成对结构域(PD)。Pax8基因的表达具有组织器官特异性,通过原位杂交方法证实,其mRNA在发育中的脑、肾、甲状腺及成熟的肾、甲状腺中存在。Pax8基因在甲状腺发育中起重要作用。ALK3基因是心脏发育和室间隔形成的重要基因,小鼠ALK3基因心脏特异性敲除后,小鼠出现室间隔缺损、心内膜垫和肌小梁发育不良1。为了研究ALK3的下游基因,我们实验室利用基因芯片与PCR选择性cDNA减数法筛选出Pax8及Hox3.5等12个基因在αMHCCre/、ALK3F/小鼠胚胎心脏中mRNA表达是下调的,其中Pax8基因的表达下降了7.1倍。原位杂交证实Pax8基因仅表达于ALK3基因敲除杂合子的小鼠胚胎心脏,而不见于ALK3基因敲除的纯合子。通过免疫组化技术检测Pax8基因在ALK3基因敲除小鼠心脏的蛋白水平中的表达,从而进一步探讨Pax8基因在心脏发育过程中的作用,及其与先天性心脏病的关系。实验证实了Pax8基因在ALK3基因敲除纯合子小鼠心脏的室间隔在蛋白水平表达上与杂合子组相比也明显减少,而在Pax8基因敲除的纯合子小鼠未见表达。以上研究表明,心脏特异性ALK3基因敲除小鼠的Pax8基因在mRNA和蛋白水平上都明显下调,从而可以证明Pax8基因与心脏发育密切相关。通过对Pax8基因敲除小鼠纯合子和杂合子心脏连续病理切片、HE染色后发现,19.5d刚出生的小鼠心脏表现为室间隔明显肥厚,左心室肥大,形状呈球形。Okuno研究证明Pax8基因敲除小鼠在生长发育过程中与杂合子相比,个体明显偏小,步态不稳,且死于断乳期9。本实验可以从mRNA和蛋白水平方面证实Pax8基因是ALK3基因的下游基因,在心脏发育中起了重要的作用。一般来说,越下游的基因组织特异性越强,Pax8下游基因是什么还需要进一步的实验研究证实。【参考文献】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