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shRNA抑制COX2基因表达对肝癌细胞HepG2生长的影响.doc

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shRNA抑制COX2基因表达对肝癌细胞HepG2生长的影响.doc

SHRNA抑制COX2基因表达对肝癌细胞HEPG2生长的影响作者杨义明刘预涂植光陈亚芹刘靳波【摘要】目的应用RNA干扰技术抑制COX2基因,观察其对肝癌细胞HEPG2生长的影响方法构建靶向抑制COX2基因表达的短发夹双链RNASHRNA真核表达载PSHRNACOX2,转染肝癌细胞HEPG2,用RTPCR和WESTERNBLOT分别从MRNA和蛋白水平检测其对COX2的抑制效应,MTT法检测对HEPG2细胞生长的影响结果与未转染组相比,PSHRNACOX2重组表达质粒抑制了HEPG2细胞COX2MRNA及蛋白表达,抑制率分别为699%和503%;并可抑制HEPG2细胞生长,72H后有统计学差异PLT;005结论PSHRNACOX2重组表达载体能显著抑制肝癌细胞COX2基因表达,从而抑制肿瘤细胞增殖【关键词】RNA干扰;重组表达载体;环氧化酶2;肝肿瘤【ABSTRACT】AIMTOINVESTIGATETHEEFFECTSOFINHIBITIONOFCYCLOOXYGENASE2(COX2)WITHRNAINTERFERENCERNAIONTHEGROWTHOFHEPATOCELLULARCARCINOMAHEPG2CELLSMETHODSTHEEUKARYOTICEXPRESSIONPLASMIDOFSHORTHAIRPINRNASHRNATARGETINGCOX2GENEPSHRNACOX2WASCONSTRUCTEDANDTRANSFECTEDINTOHEPATOCELLULARCARCINOMAHEPG2CELLS;THEEXPRESSIONSOFCOX2MRNAANDPROTEINWEREDETECTEDWITHREVERSETRANSCRIPTIONALPOLYMERASECHAINREACTIONRTPCRANDWESTERNBLOTASSAY,RESPECTIVELYTHEGROWTHOFHEPG2CELLSWASDETECTEDBYMTTRESULTSCOMPAREDWITHUNTRANSFECTEDGROUP,RECOMBINANTEXPRESSIONVECTORPSHRNACOX2RESULTEDINTHEREDUCTIONOFCOX2MRNAANDPROTEINBY699AND503RESPECTIVELY,ANDTHEGROWTHOFHEPG2CELLSWASSIGNIFICANTLYINHIBITEDAFTER72HPLT;005CONCLUSIONRECOMBINANTEXPRESSIONVECTORPSHRNACOX2CANSIGNIFICANTLYINHIBITTHEEXPRESSIONOFCOX2GENE,ANDSUPPRESSTHEGROWTHOFTUMORCELLS【KEYWORDS】RNAINTERFERENCE;RECOMBINANTEXPRESSIONVCECTORS;CYCLOOXYGENASE2;LIVERNEOPLASMS0引言环氧化酶(CYCLOOXYGENASE,COX)是催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶,包括COX1和COX2两种同工异构体近年来研究表明,许多肿瘤,如结肠癌,乳腺癌,前列腺癌,肺癌,肝癌等COX2呈高表达状态,并在肿瘤的发生、发展及转移中起重要的作用[16]研究表明选择性COX2抑制剂可以抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞调亡,而成为肿瘤基因治疗的靶点我们采用RNA干扰RNAI技术抑制COX2基因表达,观察对肝癌细胞生长的影响,为利用RNA干扰技术作为肿瘤基因治疗途径提供实验依据1材料和方法11材料真核表达质粒PGENESIL1购于武汉晶赛公司,含有人鼠人共用U6启动子和编码绿色荧光蛋白的报告基因COX2靶基因序列AACATGGAATTACCCAGTTTGSHRNA转录DNA模板正向链为5′GATCCCATGGAATTACCCAGTTTGTTCAAGAGACAAACTGGGTAATTCCATGTTTTTGTCGAA3′,反向链为5′AGCTTGTCGACAAAAACATGGAATTACCCAGTTTGTCTCTTGAACAAACTGGGTAATTCCATGG3′,以上片段由上海生工公司合成经BLAST与现有人类基因无同源性的序列5′GACTTCATAAGGCGCATGC3′作为阴性对照,称为HK(武汉晶赛合成)肝癌细胞株HEPG2,大肠杆菌JM109由本实验室保存RPMI1640(HYCLONE),新生小牛血清(杭州四季青公司产品),阳离子脂质体转染试剂LIPOFECTAMINETM2000INVITROGEN,HINDⅢ,BAMHⅠ,RTPCR试剂(大连宝生物公司产品),COX2一抗(SANTACRUZ产品),COX2二抗,DAB显色试剂(北京中杉公司产品)肝癌细胞株HEPG2用含100ML/L小牛血清的RPMI1640培养基于37℃,50ML/LCO2培养箱常规培养,待细胞铺满瓶底80%左右时传代12方法将合成的单链DNA片段用退火缓冲液稀释,等摩尔混合94℃5MIN,缓慢降至室温形成互补双链HINDⅢ,BAMHⅠ双酶切质粒PGENESIL1,凝胶回收大片段线性DNA,T4连接酶4℃过夜连接,转化感受态大肠杆菌JM109,铺含卡那霉素的LB抗性板培养16H,挑取菌落,增菌,提取质粒,酶切鉴定并测序确认实验分为3组未转染细胞HEPG2组,PSHRNACOX2组,阴性对照HK组用25G/L的胰酶常规消化对数期生长的细胞,稀释成1108/L,每孔2ML,接种于六孔培养板,待细胞铺满80%左右时转染首先用无血清无双抗RPMI1640培养基洗涤2遍质粒4ΜG,加无血清无双抗RPMI1640培养基250ΜL,脂质体10ΜL,加无血清无双抗RPMI1640培养基250ΜL,静置5MIN,将二者轻轻混匀,静置20MIN,加六孔入培养板常规培养,4~6H换生长培养液,24H转种培养瓶G418筛选初始终浓度800MG/L,4D左右大部分未转染细胞将被处死,维持终浓度400MG/L,2~3WK收集细胞,供RTPCR和WESTERNBLOT分析121肿瘤细胞中COX2MRNA和蛋白的检测常规胰酶消化收集细胞,冷PBS洗涤2遍,按试剂盒说明书提取细胞总RNA,逆转录成CDNAPCRCOX2引物序列P15′TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT3′,P25′AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT3′,扩增片段长度304BP内参ΒACTIN引物序列P15′GGGACCTGACTGACTACCTC3′P25′CGTCATACTCCTGCTTCCTG3′,扩增片段长度543BPPCR循环94℃40S,55℃30S,72℃50S,38个循环WESTERNBLOT主要步骤用RIPA(含PMSF蛋白酶抑制剂)细胞裂解液提取总蛋白,蛋白变性上样,行100G/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳,转NC膜,用50G/L脱脂奶粉的TBST封闭2H,加COX2多抗(1∶200),4℃过夜,TBST洗涤3次(10MIN/次),二抗(1∶5000)室温2H,洗涤3次,每次10MIN,DAB显色数码照相122MTT实验检测细胞生长情况用25G/L胰酶将对数期生长细胞消化下来,稀释成1108个/L,转种96孔板,每孔200ΜL,置于37℃,50ML/LCO2培养箱培养,分别于24,48,72,96,168H时,每孔加终浓度为5G/LMTT200ΜL,继续培养3H,终止反应弃去上清液,加DMSO200ΜL/孔,充分振荡10MIN,酶标仪(波长570NM)测定吸光度A值每组3个复孔,取其平均吸光度A值,比较个组细胞生长情况统计学分析RTPCR和WESTERNBLOT结果用QUANTITYONE软件分析灰度值,计算抑制率MTT结果采用均数标准差表示,组间均数比较用单因素方差分析,PLT;005为有统计学意义2结果21PSRNACOX2重组质粒测序和转染挑取卡那霉素抗性板上生长的菌落,增菌并提取质粒,HINDⅢ,BAMHⅠ双酶切切出400BP左右的DNA片断,经测序插入片断序列正确(图1)PSHRNACOX2重组质粒转染48H时,转染率为50左右(图2)22SHRNACOX2重组质粒对COX2表达的影响与未转染细胞相比,PSHRNACOX2重组质粒对ΒACTIN无抑制作用,而对靶基因COX2MRNA有明显的抑制作用,抑制率为699%,未转染细胞与阴性对照之间没有差异(图3A)与未转染细胞与未转染细胞相比,ΒACTIN及阴性对照HK几乎无变化,而转染PSHRNACOX2质粒的细胞COX2蛋白表达水平明显下降,抑制率为503%(图3B)23PSHRNACOX2重组质粒转染对细胞增值的影响与未转染细胞相比,PSHRNACOX2重组质粒转染后,24,48H时吸光度A值变化不明显,而72H后吸光度A值明显下降说明72H后细胞增殖开始得到抑制转染阴性对照质粒HK的细胞与未进行转染的HEPG2细胞相比,转染后24,48,72,96,168H细胞生长和增殖均未受到影响(图4)3讨论RNA干扰(RNAINTERFERENCE,RNAI)是通过双链RNA介导同源性MRNA的特异性降解,导致转录后基因沉默,作为一种高效、特异的基因调节技术,目前已经成为研究基因功能的有力工具RNAI现象的发现也为肿瘤的基因治疗提供了新的方法利用RNAI技术抑制HTERT,SURVIVIN的表达,可以起到抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞调亡,达到治疗肿瘤的目的[78],显示出RNAI技术在肿瘤基因治疗中的巨大潜力小干扰RNA(SMALLINTERFERINGRNA,SIRNA)可在哺乳细胞中诱导特异性基因沉默SIRNA可通过化学合成、体外转录或核酸内切酶降解等途径合成,但化学合成成本昂贵,内切酶可导致非特异性效应,且有SIRNA瞬时转染介导的沉默效应持续时间短的缺点如果将转录SIRNA的DNA模板克隆至RNA聚合酶III的下游,可在细胞内持续转录产生小RNA分子,通过自身折叠形成发夹样(HAIRPIN)结构,即内源性SIRNA,可与靶基因结合降解MRNA,实现靶基因的持续抑制,可克服上述缺点我们将靶向抑制COX2基因的SIRNA的DNA转录模板插入到质粒PGENESIL2的U6启动子下游,转录的MRNA通过自身折叠形成发夹样结构(SHRNA),经DICER酶切割形成SIRNA,供探讨其对靶基因COX2抑制效应我们构建的靶向抑制COX2基因的重组表达质粒转染肝癌细胞HEPG2后COX2基因及蛋白显著下调,抑制率分别为699%和503%,而对内参基因ΒACTIN没有影响,提示利用RNAI技术抑制COX2基因表达是切实可行的MTT实验显示,PSHRNACOX2重组质粒转染HEPG2细胞72H后,细胞增殖明显减慢,与未转染细胞组相比有显著性差异(PLT;005),并可持续至少1WK本研究表明,利用RNAI技术可抑制COX2表达,进而抑制肿瘤细胞增殖,为高表达COX2基因的恶性肿瘤基因治疗新途径提供了实验依据基金项目重庆市自然科学基金项目(2006BB5271)【参考文献】[1]SINGHB,BERRYJA,SHOHERA,ETALCOX2OVEREXPRESSIONINCREASESMOTILITYANDINVASIONOFBREASTCANCERCELLS[J]INTJONCOL,2005,26513931399[2]郭贵龙,姚榛祥,吴坚环氧化酶-2基因在人乳腺癌中的表达及临床意义[J]中华医学杂志,2003,83(19)16611664[3]LUS,YUG,ZHUY,ETALCYCLOOXYGENASE2OVEREXPRESSIONINMCF10FHUMANBREASTEPITHELIALCELLSINHIBITSPROLIFERATION,APOPTOSISANDDIFFERENTIATION,ANDCAUSESPARTIALTRANSFORMATION[J]INTJCANCER,2005,1166847852[4]YUANA,YUCJ,SHUNCT,ETALTOTALCYCLOOXYGENASE2MRNALEVELSTUMORANGIOGENESISANDPROGNOSISINNONSMALLCELLLUNGCANCERPATIENTS[J]INTJCANCER,2005,1154545555[5]WANGW,BERGHA,DAMBERJECYCLOOGENASE2EXPRESSIONCORRELATESWITHLOCALCHRONICINFLAMMATIONANDTUMORNEOVASCULARIZATIONINHUMANPROSTATECANCER[J]CLINCANCERRES,2005,11932503256[6]IWAMOTOA,IKEGUCHIM,MATSUMOTOETALTUMORCYCLOOXYGENASE2GENESUPPRESSLOCALIMMUNERESPONSESINPATIENTSWITHHEPATOCELLULARCARCINOMA[J]TUMROI,2006,922130133[7]张鹏辉,涂植光,杨明清,等RNA干扰技术靶向HTERT基因治疗肝癌的实验研究[J]癌症,2004,23(6)619625[8]闫歌,蒲丹,唐霓,等RNA干扰技术对肝癌细胞内源性SURVIVIN基因表达的影响[J]生物化学与生物物理进展,2004,31(9)829832

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