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siRNA对胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子基因表达的作用.doc

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siRNA对胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子基因表达的作用.doc

siRNA对胃腺癌细胞株SGC7901血管内皮生长因子基因表达的作用【关键词】RNA干扰胃肿瘤血管内皮生长因子类基因表达[摘要]目的研究siRNA对人胃腺癌细胞株SGC7901血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的影响。方法利用体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段,转录针对VEGFmRNA的siRNA,通过脂质体2000将合成的siRNA转染入SGC7901细胞,设置转染VEGF错义序列组、脂质体组、空白对照组作为对照,用MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞周期的改变,RTPCR检测转染后VEGFmRNA表达水平的变化,ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化。结果所设计的两个靶位点siRNA均能有效抑制胃腺癌细胞的生长,并使细胞周期阻滞于G0/G1期VEGFmRNA的表达也受到有效抑制,明显减少同时,对应的VEGF蛋白水平也显著降低,作为阴性对照的错义序列组siRNA则没有出现这种变化。结论体外转录合成的siRNA可抑制胃腺癌SGC7901细胞VEGF基因的表达。[关键词]RNA干扰胃肿瘤血管内皮生长因子类基因表达[ABSTRACT]ObjectiveToevaluatethegeneexpressionofVEGFbyRNAinterferenceinhumangastriccancer.MethodssiRNAstargetingVEGFmRNAwasobtainedbyinvitrotranscription,whichwastransfectedintohumangastriccancercelllinesSGC7901withLipofectamine2000.Thenontransfectedcells,cellstreatedwithLipofectimineandcellstreatedwithSCRweretakenascontrols.MTTwasusedtodetecttheinhibitiverateofcellgrowth.Flowcytometrywasusedtodetectthechangesofcyclingofthecell.TheinhibitiveeffectofsiRNAonmRNAlevelwasdetectedbyRTPCR,thesecretionofVEGFproteininthesupernatantbyELISA.ResultsThesmallinterferingRNA(siRNA)targetinghumanVEGFeffectivelyinhibitedtheproliferationofgastriccancerSGC7901.Itaffectedthedistributionofcellcycle,increasedcellpopulationinG0/G1phaseanddecreaseditinSphase.TheexpressionofVEGFmRNAwassignificantlyinhibitedinSGC7901otherwise,VEGFproteinnotablydecreased,buttheeffectsdidnotappearincontrolscramblesiRNA.ConclusionThelevelofVEGFgeneexpressionofSGC7901cellscanbedeclinedbytransfectedwithsiRNA.[KEYWORDS]RNAinterferencegastricneoplasmsvascularendothelialgrowthfactorgeneexpression肿瘤血管的形成受多种因子的调节,其中血管内皮生长因子(VEGF)是作用最强、特异性最高的一种能刺激细胞运动和肿瘤血管生成的因子,与肿瘤的发生、发展关系密切。将外源性或内源性双链RNA(dsRNA)导入细胞后引起与该段RNA同源的mRNA产生特异性降解,其相应的基因受到抑制,这种发生在转录后的基因静寂现象被称为RNA干扰(RNAi)[1~3]。体内外实验证实,21~23bp的siRNA(smallinterferenceRNA)可特异性地发挥RNAi作用[4]。胃癌是我国最常见的消化道肿瘤,其病死率居各种恶性肿瘤之首[5~7]。探索治疗胃腺癌的新方法具有重要临床价值。本实验以VEGF基因为靶标,设计合成siRNA,通过脂质体转染的方法将其转入胃腺癌细胞株SGC7901,研究其静寂VEGF基因表达的效应,为临床进一步应用提供理论依据。现将结果报告如下。1材料和方法1.1材料及其来源SGC7901细胞购自中国协和基础学院细胞中心。DMEM培养基、LipofectamineTM2000、TRIzolReagent、RPMI1640购自Invitrogen公司。T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem试剂盒、AccessRTPCRIntroductorySystem购自Promega公司。四唑氮蓝(MTT)购自Sigma公司。人VEGFELISAKit购自武汉博士德生物工程有限公司。1.2siRNA的制备从GenBank中获取已知的人VEGFmRNA序列(ACCESSIONAB021221)。依据Promega公司提供的设计软件和试剂盒设计合成siRNA序列,见表1。表1设计合成的siRNA序列(略)1.3细胞培养SGC7901细胞用含体积分数0.10新生牛血清的RPMI1640培养基,于37℃、体积分数为0.05CO2条件下培养。1.4MTT法检测细胞抑制率取对数生长期的SGC7901细胞,配制6107/L浓度的细胞悬液,加到96孔板内(Corning,美国),每孔加100μL。设空白对照组、脂质体组、错义序列组(错义序列组SCR序列与siRNA2序列有相同的GC组成,但是和人的mRNA没有明显的同源性,以此作为阴性对照[8])、siRNA各剂量组,每组5孔,接种24h后弃去上清,采用脂质体包裹的方式转染siRNA。siRNA1和siRNA2两组分别设立4个浓度,分别为100、200、400、1000nmol/L,分别定义为低、中、高、极高剂量组siRNASCR组只设200nmol/L,加含各浓度的siRNAOptiMEM培养基100μL脂质体组只加脂质体,空白对照组只加OptiMEM培养基100μL,置于37℃、含体积分数0.05CO2、无血清培养基中继续培养6h,每孔补加新生牛血清10μL,继续培养。脂质体组LipofectamineTM2000用量为每孔0.5L,按LipofectamineTM2000使用说明书操作。于24h后分别加入MTT10μL,振荡15min,酶标仪读出吸光度(A)值。计算细胞抑制率。1.5流式细胞仪观察转染siRNA后细胞的凋亡各组细胞以1.5105/L密度接种于25cm2培养瓶,以1.4方法转染后继续培养48h,胰酶消化离心收集并悬于PBS中,4℃、体积分数0.70的乙醇固定30min,用含RNase及碘化丙锭(PI)的染色液染色30min。应用流式细胞仪(EPICSELITEESP)进行细胞周期分析,每个样本约检测11000个细胞,计算各期细胞数占细胞总数的百分率。1.6RTPCR检测转染细胞VEGFmRNA表达水平各组细胞以1.0105/L密度接种于6孔板,24h后弃去上清,加入siRNA1、siRNA2、siRNASCR200nmol/L,按1.4方法转染24h后胰酶消化,离心收集。TRIzol提取各组细胞总RNA,取1g总RNA进行RTPCR扩增。VEGF引物上游引物5′TCCGGGCCTCCGAAACC3′,下游引物5′CCTGGTGAGATCTGG3′,扩增产物为421bp内参照GAPDH(甘油醛3磷酸脱氢酶)引物上游5′ACTGCCACCCAGAAGACT3′,下游5′GCTCAGTGTAGCCCAGGAT3′,扩增产物为292bp。将PCR扩增产物在20g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳观察并照相,然后应用天能分析软件对条带进行扫描,检测各组VEGFmRNA与其对应的内参GAPDHmRNARTPCR产物的吸光度(A)值,计算AVEGF/AGAPDH的比值。1.7VEGF蛋白分泌量分析收取转染24h后细胞上清用于检测VEGF蛋白分泌量。严格按试剂盒说明操作,将不同浓度的VEGF标准品(7.8、15.6、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0、1000.0ng/L)以及不同组细胞上清液于Rayto2100C酶标仪中检测450nm吸光度(A)值。读板后仪器自动绘制标准曲线并计算出各待测样本的VEGF含量。2结果2.1siRNA对SGC7901细胞生长的抑制siRNA1、siRNA2的低、中、高剂量组的吸光度值与空白对照组比较,差异均有极显著意义(F12.264,q9.827~10.260,Plt0.01)极高剂量组的吸光度值与脂质体组比较差异有显著意义(q7.231,Plt0.05)。错义序列组、脂质体组与正常对照组比较差异无显著性(Pgt0.05)。不同剂量各组之间比较,中剂量组吸光度值最低,抑制率最高(q10.198~10.260,Plt0.001)。见表2。2.2细胞转染siRNA后对细胞周期的影响与空白对照组比较,siRNA作用的细胞G0/G1期(细胞静止期和DNA合成前期)比例升高,S期(DNA合成期)比例降低错义序列组、脂质体组与空白对照组比较无明显差异。见表3。2.3细胞转染siRNA后各组VEGFmRNA表达水平电泳结果显示,空白对照组、脂质体组、错义序列组421bp处均见清晰条带,siRNA各组条带均明显减弱(见图1),各组内参照GAPDH条带一致。空白对照组、脂质体组、siRNASCR组、siRNA1组、siRNA2组AVEGF/AGAPDH比值分别为0.856±0.009、0.834±0.020、0.815±0.017、0.456±0.030、0.468±0.019,siRNA1、siRNA2与空白对照组、脂质体组、错义序列组比较,差异均有极显著意义(F244.945,q27.427~30.560,Plt0.01),其他各组比较差异无显著性。2.4siRNA转染后24h各组VEGF蛋白分泌量的变化siRNA1和siRNA2组的VEGF蛋白分泌量明显低于其他3组,差异均有显著性(F33.131,q9.036~12.154,Plt0.01)。见表4。表2转染siRNA各组SGC7901细胞24h抑制率(略)表3流式细胞仪检测细胞周期变化(略)图1转染siRNA后SGC7901细胞VEGFmRNA表达水平(略)①DNAMarker②siRNA1③siRNA2④脂质体组表4各组SGC7901细胞上清VEGF蛋白分泌量的比较(略)3讨论胃腺癌是人类常见的癌症之一,严重威胁人类的健康和生命,发病率呈逐年上升的趋势。手术治疗可以使其中一部分病人得到治愈,但更多的病人面临错失手术时机以及术后肿瘤复发的局面。在分子生物学迅速发展的今天,寻找一条有效的胃腺癌基因水平的治疗方法具有重要的临床价值。微血管的生成与肿瘤的生长、发展与转移密不可分,抑制血管生成已成为近年来抗肿瘤治疗研究的重要课题和热点问题。肿瘤血管的形成受多种因子调节,其中最重要的一种是VEGF,它不仅促进血管生成,还增加血管通透性,促进转移,改变宿主免疫功能。VEGF基因位于染色体的6p21.3,全长28kb,编码VEGF的基因长约14kb,由8个外显子和7个内含子交替构成。其mRNA的不同剪接可以产生5种异构体,即VEGF121、145、165、189及206[9]。其中VEGF165是最为常见的形式,在包括胃腺癌在内的多种肿瘤中有表达[10,11],在肿瘤微血管生成过程中扮演重要角色。通过抑制VEGF的表达抑制肿瘤微血管形成是当前抗肿瘤研究的热点之一。RNAi作为生命科学领域的新技术,其应用非常广泛,从单细胞生物一直到人,作为基因表达干预的理想方法,可应用于病毒和肿瘤的基因治疗[12,13]。本研究以人胃腺癌细胞系SGC7901为对象,利用分子生物学技术设计、体外转录针对VEGF基因的两组siRNA,转染体外培养的SGC7901细胞,遏制VEGF基因的表达,研究胃腺癌的防治方法。结果表明,siRNA对VEGF基因从mRNA转录到蛋白质表达均具有明显的抑制效果,抑制了胃腺癌细胞SGC7901的增殖,促进细胞凋亡,改变细胞周期,降低VEGFmRNA表达水平及蛋白表达水平。由此可见,在胃腺癌的抗血管生成基因治疗中,VEGF可以成为有效的靶位点。本文实验所用体外转录试剂盒所转录出来的siRNA纯度高,可直接应用于体外培养细胞的转染。脂质体带正电,可以靠静电作用结合RNA形成RNA阳离子脂质体复合物,同时又吸附在带负电的细胞膜表面。因此,脂质体转染法在短期应用的基因治疗中具有明显优点。总之,本文为RNAi应用于肿瘤的基因治疗提供了一些实验基础,验证了应用RNA干扰技术可以有效抑制肿瘤相关基因的表达,从而抑制瘤细胞的增殖、防治肿瘤的基因治疗思路,为下一步动物实验奠定了基础。当然,针对VEGF的RNAi技术临床应用于胃腺癌治疗尚需要进一步的细胞实验以及动物实验。[参考文献][1]FIREA.RNAtriggeredgenesilencing[J].TIG,1999,15(9)358363.[2]FIREA.PotentandgeneticinterferencebydoublestrandedRNAinCaenorhabditiselegans[J].Nature,1998,391806811.[3]项锋钢,马桂馨.肺癌组织中血管内皮生长因子受体Flt1及KDR的表达及其与肿瘤转移和预后的关系[J].青岛大学医学院学报,2004,40(1)810.[4]杨光,曹国军,李洁,等.SiRNA抑制SARS冠状病毒感染VeroE6细胞[J].医学分子生物学杂志,2004,1270273.[5]吴汉平,吴开春,李玲,等.人环氧合酶2(hCOX2)编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究[J].世界华人消化杂志,2000,812111217.[6]邓大君,鄂征.胃癌病因人N亚硝酰胺暴露[J].世界华人消化杂志,2000,8250252.[7]薛绪潮,方国恩,华积德.胃癌与细胞凋亡[J].世界华人消化杂志,1999,7359361.[8]TAKEIY,KADOMATSUK,YUZAWAY,etal.AsmallInterferingRNAtargetingvascularendothelialgrowthfactorascancertherapeutics[J].CancerRes,2004,64(10)365370.[9]杨英.血管内皮生长因子在肿瘤中的作用[J].国外医学肿瘤学分册,2004,12(31)1820.[10]KOLLERMANNJ,HELPAPB.ExpressionofvascularendothelialgrowthfactorandVEGFreceptorFlk21inbenign,premalignantandmalignantprostatetissue[J].AmJClinPathol,2001,116(1)115121.[11]马占龙,邓红.VEGF及其促肿瘤血管形成作用的研究进展[J].江苏医药,2004,30(1)5051.[12]吴元明,陈苏民.RNA干涉的最新研究进展[J].中国生物化学与分子生物学报,2003,19(4)411417.[13]杨剑,糜漫天.反义RNA技术与肿瘤研究进展[J].国外医学肿瘤学分册,2002,29(2)8386.

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