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TK自杀基因的构建及鉴定.doc

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TK自杀基因的构建及鉴定.doc

TK自杀基因的构建及鉴定【摘要】目的利用分子生物学技术,构建胸苷激酶基因(TK)自杀基因并测定其结构,为该自杀基因的进一步研究提供良好的实验基础。方法以人类单纯疱疹病毒Ⅰ(HSV1)基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应(PCR)法,扩增出约为1100bpTK基因,定向克隆到载体PEGMT,构建克隆载体。两端分别引入限制性内切酶NotⅠ、XholⅠ酶切位点,经PCR及酶切鉴定初步证实为重组体后,测序认证。结果经PCR、酶切鉴定和测序鉴定完成TK基因的构建,同源性高达98.70,完全具备表达该目的基因的要求。结论成功扩增出TK基因,为继续研究打下基础。【关键词】TK基因自杀基因聚合酶链反应AbstractObjectiveToconstructthesuicidegeneherpessimplexvirusthymidinekinasegeneHSVTKandtosequenceitsstructureforidentification.MethodsTheTKgenefragmentwasamplifiedbyPCRfromthegenomeDNAofherpessimplexvirus.ThePCRproductwasclonedtothevectorPEGMT.TheinterestedTKgenefragmentintherecombinantplasmidobtainedwasconfirmedbyPCR,enzymedigestionandsequencing.ResultsTheTKgenewassuccessfullyobtained.Theproductwas98.70original.ConclusionTheconstructionofTKgenemayhelpstarttheresearchintothesuicidegenestrategyforthecontrolofcancers.KeywordsthymidinekinasesuicidegenepolymerasechainreactionPCR将某些细菌及病毒中特有的药物敏感基因转导入肿瘤细胞,使肿瘤细胞产生某些酶类,将原来无毒或低毒的前体药物代谢转化成细胞毒性产物而杀伤宿主细胞,这种使肿瘤细胞自杀的基因称为自杀基因[1]。肿瘤的自杀基因疗法首创于1986年,为目前研究的热点,其中研究最多的当属单纯疱疹病毒胸苷激酶HSVTK基因。本实验构建了TK基因,以期为进一步研究自杀基因系统的抗肿瘤机制及各种肿瘤基因治疗作用打下基础。1材料和方法1.1材料本实验克隆载体PEGMT购自Promega公司病毒株为人类单纯疱疹病毒Ⅰ(HSV1)作为TK基因模板抽提病毒,购自武汉中国病毒库大肠杆菌JM109作为宿主菌,由徐州医学院病理学教研室提供。主要试剂盒和实验试剂PCR扩增试剂盒、DNA胶回收试剂盒、限制性内切酶、T4DNA连接酶为Fermentas公司产品,核酸分子标准品(DL1500Marker)、DNAmarkerLambdapUCMixMarker为Takara公司产品,特异性引物TK基因引物按照分子克隆实验指南引物设计原则,并且加入特定的酶切位点,由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物P15′TAGCGGCCGCATGGCTTCGTACCCCTGCCATC3′NotⅠ下游引物P25′GCCTCGAGGTTAGCCTCCCCCATCTC3′XholⅠ1.2方法1.2.1HSV1基因组DNA的抽提HSV1加入50mlLB液,250r/min37℃摇菌过夜。上海生工生物工程有限公司基因组DNA分离纯化试剂盒用于提纯基因组DNA(按操作说明书进行)。1.2.2PCR扩增目的基因片段以HSV1基因组DNA为模板进行PCR扩增。50μlPCR反应体系中含HSV1基因组DNA模板3.0μl,dNTP2.0mol/L5μl,MgCl21.0mol/L2μl,引物各为5pmol,Tag酶0.5μl。反应参数94℃预变性5min后,94℃变性60s,56℃退火90s,72℃延伸75s,35个循环后,72℃最终延伸20min。1.2.3TK基因的全序列测定取含TK基因片段的PCR扩增产物50μl,1琼脂糖凝胶电泳分离纯化TK基因(1100bp)。取纯化产物3μl加入载体PGEMT1μl,在T4DNA连接酶作用下,18℃连接过夜,构建PGEMTTK重组质粒。取连接产物转化感受态细胞大肠杆菌JM109后,接种Amp抗性、IPTG、xgal琼脂培养皿,利用蓝白斑菌显色,挑选阳性重组子。取阳性克隆菌落,摇菌过夜,提纯质粒后,分别用T及SP6通用测序引物从两端测定基因全序列(委托上海生工生物工程有限公司测序),Omega基因分析软件进行基因序列分析。2结果2.1PCR扩增结果经1琼脂糖凝胶电泳鉴定表明,TK基因片段约为1100bp,扩增的片段大小与预计一致。见图1。图1TK基因的PCR扩增图M为Marker,TK为编码胸苷激酶(TK)的基因2.2重组质粒的酶切鉴定重组质粒PEGMTTK经NotⅠ、XholⅠ酶切,切出片段约分别为1100bp、3000bp,与预计大小一致。见图2。图2PFGMTTK质粒酶切分析图M为Marker,1为PEGMT载体(3000bp),2为TK基因(1000bp)2.3测序结果分别用T7及SP6通用测序引物从两端测定基因全序列,以达到测通目的基因全部碱基序列的目的。利用DNAStar分析软件与GenBank提供的TK基因序列对比,同源性高达98.70。3讨论TK基因是编码胸苷激酶的基因,病毒、细菌、真核细胞及其线粒体内均存在TK基因。不同来源的TK基因结构及其蛋白产物的分子大小、理化性质和生化功能均不同。肿瘤基因治疗中,常用的有单纯疱疹病毒HSV和水痘带状疱疹病毒VZV的TK基因。HSV1TK/GCV系统治疗恶性肿瘤是研究最广泛的自杀基因治疗方法之一。HSV载体携带胸苷激酶基因(TK基因),进入肿瘤细胞并表达HSVTK基因,HSVTK基因编码胸苷激酶活化后,使抗病毒药物丙氧鸟苷(GCV)三磷酸化,抑制癌细胞的DNA聚合酶活性或代替Dtp渗入到细胞DNA中,抑制DNA聚合酶并掺入DNA合成链中,引起链中止、染色体变性和姐妹染色单体交换,使癌细胞的DNA、蛋白质合成受到抑制,肿瘤细胞死亡,从而达到治疗癌症的目的。因此,细胞增殖越快,则GCV对其作用越明显[2]。此外,由于HSVTK/GCV存在旁观者效应而扩大对肿瘤细胞的杀伤效应。Kuriyama等[3]用HSVTK基因转染肝癌细胞,不仅转染了HSVTK基因的肝癌细胞大量死亡,而且周围大量未转染的肝癌细胞亦有大量死亡的现象,其机制可能与细胞间连接有关。HSVTK/GCV系统还可以通过诱导机体免疫反应,使肝癌周围组织中CD4()和CD8()T淋巴细胞大量浸润,从而抑制肝癌细胞增殖。基于目前国内外的研究现状,TK基因引物是[4]根据分子克隆实验指南引物设计的原则,利用GenBank发表的DNA序列上下游分别截选一段核苷酸序列所成,并在上、下游引物中加入目的片段和载体中没有的特异的酶切位点NotⅠ、XholⅠ,利用酶切鉴定。进行DNA重组重要的是解决目的基因的获得和如何将目的片段进行适当连接两个关键问题。采用PCR方法从含有目的基因的人类单纯疱疹病毒基因组中扩增出目的基因片段,然后通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,回收需要的目的基因片段,通过载体特有的T末端和PCR扩增目的片段两端形成的ployA尾巴,用DNA连接酶进行连接,得到了克隆质粒。【参考文献】[1]MooltenFL.Tumorchemosensitivityconferredbyinsertedherpesthymidinekinasegenesparadigmforaprospectivecancercontrolstrategy[J].CancerRes,1986,46(10)52765281.[2]SungMW,YehHC,ThungSN,etal.IntratumoraladenovirusmediatedsuicidegenetransferforhepaticmetastasesfromcolorectaladencarcinomaresultsofaphaseIclinicaltrial[J].MolTher,2001,43182191.[3]KuriyamaS,MasuiK,KikukawaM,etal.Completecureofestablishedmurinehepatocellularcarcinomaisachievablebyrepeatedinjectionsofretrovirusescarryingtheherpessimplexvirusthymidinekinasegene[J].GeneTherapy,1999,64525533.[4]萨姆布鲁克J,拉塞尔DW.分子克隆实验指南[M].第2版.北京科学出版社,2002679684.

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