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β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定.doc

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β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定.doc

β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定作者邱文洪吴丽娜叶许楚娟易路阳郭凯文【摘要】目的构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体并鉴定。方法通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆β半乳糖苷结合凝集素9基因,插入真核表达载体pcDNA3.1中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果DNA测序和酶切鉴定证明β半乳糖苷结合凝集素9基因正确克隆至pcDNA3.1的多克隆位点。结论成功构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体pGal9。【关键词】Gal9构建真核表达载体半乳糖凝集素家族galectinfamily成员参与了许多生理和病理过程,包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等1,2。β半乳糖苷结合凝集素9Gal9是一种糖结合蛋白,属于半乳糖凝集素家族galectinfamily成员,组织分布广泛,在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控和肿瘤转移等方面,发挥着重要作用3。目前对Gal9发挥作用的具体机制仍知之甚少,值得进一步深入探讨和研究,从而使Gal9作为疾病治疗的新的靶点成为可能。为此,本研究拟通过构建表达人Gal9蛋白的真核表达载体,为进一步研究Gal9的作用机制打下基础。1材料和方法1.1材料T4连接酶、限制性内切酶MBI,Taq酶和RT试剂盒Promega,RNA提取试剂盒Invitrogen,质粒提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒Qiagen,DNAmarkerTiangen,Trizol、1640培养基,人淋巴细胞分离液天津灏洋生物制品科技有限责任公司,胎牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司,Galectin9引物英骏生物技术有限公司。1.2引物设计参照GenBank上Gal9NM009587.2序列设计引物如下上游引物P15CCAAGCTTGGGTTAAGTCGTTCCCTCTACAA3,下游引物P25CGGAATTCCGAGGACCCAGACTGCCCCAC3,下划线分别为HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,扩增Gal9的CDS序列,共1176bp。1.3分离人外周血单个核细胞静脉取血,加入肝素溶液10~50u/m1血样本抗凝,用pH7.2Hanks液将抗凝血稀释1倍吸取人淋巴细胞分离液置于刻度离心管中,加入稀释的全血2000r/min离心20min吸取所有单个核细胞,用Hanks液洗涤细胞3次。将单个核细胞离心收集备用。1.4单个核细胞总RNA的制备、RTPCR及克隆入载体pcDNA3.1将离心收集的单个核细胞1105加入Trizol1mL,混匀,室温5min加0.2mL氯仿,涡旋15s,4℃12000g,离心10min,吸取上清液至另一1.5mLEppendorf管,加入等体积预冷的异丙醇,放置10min,4℃12000g,离心10min,去上清液,加入1mL预冷的浓度为750mL/L乙醇,充分混匀振荡,4℃12000g,离心10min,去上清液,充分干燥,用50μL含1mL/LDEPC的ddH2O溶解沉淀,获得细胞总RNA。取5μL总RNA,按RTPCR试剂盒推荐方法以oligodT为引物合成cDNA第一链。取2μl逆转录产物为模板,加入10mMdNTP1.5ml,10′PCR缓冲液5m,l50mMMgSO41m,l两引物各10pmo,l补水至50m,lPCR反应条件为95℃预变性5min,94℃变性15s,55℃退火30s,72℃延伸1min,反应30个循环后,72℃延伸10min。取PCR产物经1的琼脂糖凝胶电泳分析。按照WizardPCR产物纯化试剂盒说明书纯化,回收PCR产物,经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切,定向插入表达载体pcDNA3.1的相应位点。该质粒命名为pGal9,经PCR、HindⅢ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定序列的正确性。1.5统计学方法采用Prism4.0软件行单因素方差分析,以及组间比较。Plt0.05为差异有统计学意义。2结果2.1Gal9的RTPCR扩增从单个核细胞中提取细胞总RNA,以此为模板,应用前述引物进行RTPCR,将扩增产物于10g/L琼脂糖电泳中,可见分布于Marker1.0~1.5kb的特异条带,与预计长度1176bp相符图1。2.2真核质粒pGal9构建和鉴定将RTPCR扩增产物,经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后,克隆入真核表达质粒pcDNA3.1。阳性克隆送英骏公司测序,同时进一步对阳性重组质粒进行PCR和双酶切鉴定。以阳性重组质粒为模板,用前述特异性引物进行PCR,可扩增出与预计长度1176bp相符的目的片段,而空载体则为阴性结果图2A。阳性重组质粒经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后电泳,同样可见与预计长度相符的片段图2B。测序结果表明,PCR扩增获得并克隆的Gal9片段序列与GenBank中的序列完全一致结果未附。1Marker2RTPCRproductofGal9gene图1RTPCR扩增Gal9基因CDS序列APCRanalysis1Marker2PCRproductofpGal93PCRproductofpcDNA3.1BDoublerestrictionenzymedigestionanalysis1Marker2pcDNA3.1dynamitindigestedwithHindⅢandEcoRⅠ3pGal9dynamitindigestedwithHindⅢandEcoRⅠ。图2真核表达质粒pGal9的PCR和双酶切鉴定3讨论半乳糖凝集素家族galectinfamily是含有一个保守糖识别域的β半乳糖苷结合凝集素。半乳糖凝集素家族有15名成员,广泛参与许多生理和病理过程,包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等1,2。β半乳糖苷结合凝集素9Gal9是一种糖结合蛋白,属于alectin家族成员,组织分布广泛,具有多种生物学活性,参与细胞聚集和粘附、增殖、死亡和调节炎症及免疫反应等多种生理和病理过程3。为进一步研究Gal9的作用机制,我们通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Gal9基因,插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建了包含Gal9基因的真核表达载体pGal9。为鉴定真核表达载体pGal9,以阳性重组质粒为模板,用前述特异性引物进行PCR,证明获得的真核表达载体pGal9可扩增出与预计长度1176bp相符的目的片段,而空载体则未见PCR扩增产物。获得的真核表达载体pGal9经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后电泳,同样可见与预计长度相符的片段。测序结果证明,PCR扩增获得并克隆的Gal9片段序列与GenBank中的序列完全一致。通过上述实验可以证明我们成功构建并获得了包含Gal9目的基因的真核表达载体pGal9。在Gal9当初被发现时,引人注意的是ECA活性4,然而随着研究的不断深入,Gal9越来越多的生物学功能被人们所了解,这使得人们对Gal9乃至整个galectin家族的兴趣日益浓厚。研究发现,Gal9通过诱导Th1细胞凋亡,抑制Th17细胞的产生,增加调节性T细胞的生成,来改善小鼠自身免疫性疾病模型的严重性,如实验性脑脊髓炎EAE5和胶原性关节炎CIA6。相信今后的免疫学研究方向不仅关注于galectin家族的其他成员,还将对Gal9发挥作用的具体机制,尤其是对免疫系统的影响作进一步深入探讨,从而使Gal9作为免疫病理性疾病治疗的新的靶点成为可能。综上所述,我们成功克隆了能够正确表达Gal9目的基因的真核表达载体pGal9,为进一步研究的Gal9功能提供方便,并为进一步探讨Gal9对免疫系统的影响奠定了基础。【参考文献】1ElolaMT,WolfensteinTodelC,TroncosoMF,VastaGR,RabinovichGA.Galectinsmatricellularglycanbindingproteinslinkingcelladhesion,migration,andsurvival.CellMolLifeSci,2007,641679~700.2HasanSS,AshrafGM,BanuN.Galectinspotentialtargetsforcancertherapy.CancerLett,2007,25325~33.3HirashimaM,KashioY,NishiN,etal.Galectin9inphysiologicalandpathologicalconditions.GlycoconjJ,2004,19593~600.4MitsuomiHirashima,YumikoKashio,NozomuNishi,etal.Galectin9inphysiologicalandpathologicalConditions.Glycoconjugate,2004,19593~600.5AndersonAC,AndersonDE,BregoliL,etal.PromotionoftissueinflammationbytheimmunereceptorTim3expressedoninnateimmunecells.Science,2007,3181141~1143.6SekiM,OomizuS,SakataKM,etal.Galectin9suppressesthegenerationofTh17,promotestheinductionofregulatoryTcells,andregulatesexperimentalautoimmunearthritis.ClinImmunol,2008,127178~88.

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