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β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定.doc

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β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定.doc

β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定作者:邱文洪吴丽娜叶许楚娟易路阳郭凯文【摘要】目的:构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体并鉴定。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆β半乳糖苷结合凝集素9基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果:DNA测序和酶切鉴定证明β半乳糖苷结合凝集素9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论:成功构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体pGal9。【关键词】Gal9;构建;真核表达载体半乳糖凝集素家族(galectinfamily)成员参与了许多生理和病理过程,包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等[1,2]。β半乳糖苷结合凝集素9(Gal9)是一种糖结合蛋白,属于半乳糖凝集素家族(galectinfamily)成员,组织分布广泛,在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控和肿瘤转移等方面,发挥着重要作用[3]。目前对Gal9发挥作用的具体机制仍知之甚少,值得进一步深入探讨和研究,从而使Gal9作为疾病治疗的新的靶点成为可能。为此,本研究拟通过构建表达人Gal9蛋白的真核表达载体,为进一步研究Gal9的作用机制打下基础。1材料和方法1.1材料T4连接酶、限制性内切酶(MBI),Taq酶和RT试剂盒(Promega),RNA提取试剂盒(Invitrogen),质粒提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒(Qiagen),DNAmarker(Tiangen),Trizol、1640培养基,人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),Galectin9引物(英骏生物技术有限公司)。1.2引物设计参照GenBank上Gal9(NM009587.2)序列设计引物如下:上游引物:P15 CCAAGCTTGGGTTAAGTCGTTCCCTCTACAA3 ,下游引物:P25 CGGAATTCCGAGGACCCAGACTGCCCCAC3 ,下划线分别为HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,扩增Gal9的CDS序列,共1176bp。1.3分离人外周血单个核细胞静脉取血,加入肝素溶液(10~50u/m1血样本)抗凝,用pH7.2Hanks液将抗凝血稀

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