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巢式竞争DNA模板的制备方法.doc

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巢式竞争DNA模板的制备方法.doc

巢式竞争DNA模板的制备方法作者郭晏海,闫小君,崔大祥,侯瑜,赵锦荣,韩锋产,段杰【关键词】DNA关键词DNA模板方法聚合酶链反应0引言我们建立了巢式竞争PCR定量方法进行血清HBVDNA定量扩增[1].在该实验中我们采用了简便的长引物引导扩增方法制备了特殊的巢式竞争DNA模板.1材料和方法1.1材料我们对HBVDNAC区18652458区段进行巢式扩增定量,而巢式扩增片段长度为559bp.按文献HBVDNA序列[2],用oligo引物设计软件和www.ncbi.nlm.nih.govDNA同源性数据库分析设计巢式引物.两外侧引物分别为b1(上游18651883)5′caagcctccaagctgtgcc3′,b2(下游24582440)5′atactaacattgagattcc3′两内侧引物分别为b3(上游18771893)5′ctgtgccttgggtggcttt3′,b4(下游24352417)5′gagatcttctgcgacgcgg3′.我们欲制备的竞争模板为459bp.为了使巢式竞争模板和待测模板一样含有上述4个引物结合序列,我们设计了一个长为57个碱基的竞争模板DNA的制备引物,该引物从5′至3′分别含有巢式扩增的下游引物b2、b4和与HBVDNAC区22862269区序列结合区序列(斜体部分)[3],竞争模板制备引物b55′ggatactaacattgagattcccgagatcttctgcgacgcggagtgcgaatccacact3′.1.2方法用该引物与b1引物组成一对PCR扩增引物对HBVDNA进行扩增.PCR反应体系内b1为10mol,b5为1pmol,扩增条件首先94℃60s,然后94℃30s,58℃50s,72℃60s共进行5次循环,然后改为94℃30s,64℃50s,72℃60s进行30次循环,最后72℃30min.于17g12539L1的琼脂凝胶电泳,从凝胶中回收扩增产物带(461bp)并纯化回收扩增产物.扩增产物克隆入dTVectorpUC19中.纯化重组pUC19质粒,然后,测定浓度,稀释后作竞争模板.2结果经上述PCR扩增后,经17g12539L1琼脂糖电泳后紫外光下观察可见461bp的扩增带将该扩增产物克隆进pUC19dT载体中,然后转入大肠杆菌,经培养后提取并纯化重组质粒,将其定量作为竞争模板与HBVDNA同时同管扩增,经17g12539L1琼脂糖电泳后,可将竞争摸板和HBVDNA的扩增产物分开,便于分别进行荧光强度的测定.3讨论该方法的优点在于可以方便制备任意长度的巢式竞争DNA模板.而且其序列是待测模板的部分,在序列结构上与待测模板的接近.实验中发现,如果按常规PCR方法进行,扩增结果往往得不到特异的扩增产物.

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