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车前草超氧化物歧化酶的分离纯化及种类鉴定.doc

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车前草超氧化物歧化酶的分离纯化及种类鉴定.doc

车前草超氧化物歧化酶的分离纯化及种类鉴定【摘要】目的从车前草中分离纯化超氧化物歧化酶(SUPEROXIDEDISMUTASE,SOD)。方法采用40乙醇作为提取液,经过丙酮沉淀,CMSEPHAROSEFASTFLOW和SEPHADEXG75柱层析,收集活性峰,冷冻干燥后即得。结果纯化的SOD经SDSPAGE显示单一条带,亚基分子量为201KDA;抑制试验显示为FESOD。结论通过两步柱层析从新鲜车前草提取液中纯化得到FESOD,其亚基分子量、颜色、紫外吸收与文献报道相近。【关键词】车前草;纯化;超氧化物歧化酶车前草又名车前、车轮菜、猪耳草等,为车前科植物车前PLANTAGOASIATICAL、平车前PDEPRESSSAWILLD[1]的干燥全草。车前以种子和全草入药,用于治疗小便不利、水肿、暑热泄泻、痰多咳嗽、热毒痛肿等。随着现代中药化学的不断发展,从车前中分离出许多有效成分[2]①多糖类;②黄酮及其苷类,如木樨草素;③环烯醚萜类,如桃叶珊瑚甙AUCUBIN、京尼平甙酸GENIPOSIDICACID等;④苯乙酰咖啡酰糖酯类,如连翘酯甙ACTEOSIDE;⑤还有熊果酸、乌苏酸、生物碱、小分子的酸性物质、Β谷甾醇苷等,从而揭示了部分传统药效的作用机制,还发现了许多传统用药所没有的新的药理作用,如镇咳祛痰、平喘、抗衰老、缓泻、抗菌等。但是对车前草中大分子成分如蛋白、多糖等的研究很少,车前草超氧化物歧化酶的分离提纯文献尚未见报道。本文探讨了从车前中分离纯化超氧化物歧化酶的方法并鉴定其种类,为植物性超氧化物歧化酶的应用提供依据。1材料与仪器11材料车前草购自广州程岗路农贸市场,由广州军区广州总医院邓伟杰主管药师鉴定为车前科植物车前PLANTAGOASIATICAL的干燥全草。12主要仪器凝胶层析系统(LKB)(PHARMACIABIOTECH);二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司);GENERALTU1901紫外分光光度计(日本岛津公司);LGJ12冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司);SORVALLRC5C低温高速离心机;电子天平TP320A(湘仪天平仪器设备有限公司);电子天平BP210SSARTORIUS(德国);垂直电泳仪(BIORAD);TGL16H台式离心机(BECKMAN公司);UNIVERSALHOODⅡ凝胶成像系统(BIORAD);BYQ6044383恒温金属浴(杭州博日科技有限公司);PHS25CPH计(上海康仪仪器有限公司)。13主要试剂超氧化物歧化酶(华灿生物制药技术公司);超氧化物歧化酶活性测定盒(南京建成生物工程研究所);葡聚糖凝胶(G75)层析填料(PHARMACIA公司);CMSEPHAROSEFASTFLOW(PHARMACIA公司);三羟甲基氨基甲烷(TRIS)(德国MERCK公司);TEMED(BIORAD);丙烯酰胺(上海奥伯生物科技有限公司);NN亚甲基双丙烯酰胺(广州化学试剂厂);十二烷基磺酸钠(SDS)(广州威佳科技有限公司,进口分装);过硫酸铵(APS)(宝泰克公司);考马斯亮蓝R250(中国医药上海化学试剂公司);牛血清白蛋白(BSA)(中国科学院上海生物化学研究所);小分子蛋白质分子量标准(MARK)(TAKARA宝生物工程有限公司);透析袋(分子量800015000)(北京鼎国生物公司)。2方法21酶活力的测定采用南京建成生物工程公司的SOD活性测定试剂盒测定样品酶活力。酶活力单位每毫升反应液中SOD抑制率达50时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U),计算公式总SOD活力(U/ML)A对照A样品/A对照50反应体系的稀释倍数样本测试前的稀释倍数22蛋白质浓度的测定采用BRADFORD法测定蛋白质浓度,最低检出量为1ΜG蛋白/ML。23酶的分离纯化231乙醇提取液浓度的确定取新鲜车前草用蒸馏水洗净,甩干表面水分,称取9份,每份50G,分成3组,粉碎后分别用30,40,50(Φ)乙醇100ML,4℃浸提4H,4层纱布过滤后收集滤液4000R/MIN离心1MIN,取上清液用量筒稀释至150ML,测定样品中的蛋白浓度和SOD活性,总体比较采用单向方差分析,多重比较采用LSD法,结果见表1。方差齐性检验F0698,P0534;三组数据总体差异显著(F8801,P0016);多重比较1∶2(P0010),1∶3(P0011),2∶3(P0942)。故选择比活较高的40乙醇作为提取液。表1不同浓度乙醇提取后比活比较(略)TAB1COMPARISONOFSPECIFICACTIVITIESAFTEREXTRACTIONWITHETHANOLATDIFFERENTCONCENTRATIONS232乙醇提取液体积的确定取新鲜车前草用蒸馏水洗净,甩干表面水分,称取9份、每份50G,粉碎后分成3组,分别用40乙醇1∶1,1∶2,1∶3(W∶V),4℃浸提4H,4层纱布过滤后收集滤液4000R/MIN离心1MIN,取上清液用量筒稀释至175ML,测定样品中的蛋白浓度和SOD活性,总体比较采用单向方差分析,多重比较采用LSD法,结果见表2。方差齐性检验F1371,P0323;三组数据总体差异显著(F72,P0025);多重比较12(P0335),1∶3(P0039),2∶3(P0010)。故选择比活较高的40乙醇,1∶1为提取工艺。表2不同体积40乙醇提取后比活比较(略)TAB2COMPARISONOFSPECIFICACTIVITIESAFTEREXTRACTIONWITHETHANOLOFDIFFERENTVOLUMES233所用丙酮体积的确定将232中第一组的3份样品合并,再平分成9份,每份58ML,分别按照1∶1,1∶2,1∶3(体积比)的比例加入丙酮沉淀(4℃,2H),而后离心收集沉淀用5ML蒸馏水溶解(4℃,1H),最后离心取上清液用容量瓶定容至10ML,测定样品中的蛋白浓度和SOD活性,总体比较采用单向方差分析,多重比较采用LSD法,结果见表3。方差齐性F1052,P0406;三组数据总体差异显著(F24645,P0000);多重比较1∶2(P0008),1∶3(P0000),2∶3(P0013)。故选择比活较高的1∶1(体积比)丙酮作为提取工艺。表3不同体积丙酮沉淀后比活比较(略)TAB3COMPARISONOFSPECIFICACTIVITIESAFTERACETONEPRECIPITATIONWITHDIFFERENTVOLUMES234粗酶液的制备取新鲜的车前全草,用蒸馏水洗净后甩干表面附着的水分,称重200G,用剪刀剪碎后置高速中药粉碎机中打成浆,移至大烧杯中按1∶1体积比加入40乙醇液,4℃浸提4H,用10000G高速冷冻离心机离心15MIN,收集上清液。按1∶1体积比缓慢加入预冷的丙酮,边加边搅拌,在4℃静至2H,3000R/MIN离心10MIN,弃去上清液,收集沉淀。加2ML蒸馏水4℃静至1H溶解沉淀,3000R/MIN离心2MIN,得上清液,用容量瓶定容至5ML,即为粗酶液。235CMSEPHAROSEFASTFLOW柱层析装柱(10MM200MM)后用PH46,002MOL/L的醋酸盐缓冲液平衡5个床体积。每次上样量04ML,流速36ML/H,紫外监测波长280NM。先用平衡液洗去杂质,换用PH46,02MOL/L的醋酸盐缓冲液洗脱,半小时后换用PH46,02MOL/L(含05MOL/L氯化钠)的醋酸盐缓冲液洗脱,收集并测定洗脱峰的蛋白浓度和SOD活力,保留活力较高的峰,透析脱盐后冷冻干燥浓缩。236SEPHADEXG75凝胶过滤装柱(10MM200MM)后用蒸馏水平衡5个床体积。经CMSEPHAROSEFASTFLOW柱层析并透析浓缩过的SOD蛋白质用2ML蒸馏水溶解后上柱,每次上样1ML,流速36ML/H,紫外监测波长280NM。收集并测定洗脱峰的蛋白浓度和SOD活力,保留活力较高的峰,冷冻干燥浓缩得到纯化的SOD酶蛋白。237亚基分子量的测定采用SDSPAGE,分离胶浓度为15%。238酶种类的鉴定采用抑制敏感性实验,CU、ZNSOD对氰化物和过氧化氢均敏感;MNSOD对氰化物和过氧化氢均不敏感,而FESOD对氰化物不敏感,对过氧化氢敏感[3]。3结果31粗酶液的纯化粗酶液过CMSEPHAROSEFASTFLOW柱分离纯化,结果如图1所示,收集峰4和峰5,合并后透析、冷冻干燥浓缩后进行G75凝胶柱纯化,结果如图2所示。收集峰1,冷冻干燥浓缩后进行SDSPAGE,结果如图3,从图3可以看出经过两步纯化得到亚基分子量201KDA的电泳纯SOD样品。图1车前草提取液的CMSEPHAROSEFASTFLOW柱层析(略)FIG1COLUMNCHROMATOGRAMOFSUPEROXIDEDISMUTASEINPLANTAINONCMSEPHAROSEFASTFLOW图2经CMSEPHAROSEFASTFLOW柱分离的SOD的G75凝胶过滤图形(略)FIG2GELFILTRATIONPATTERNSTHROUGHCMSEPHAROSEFASTFLOWCOLUMNOFSODSEPARATEDBYG75COLUMNCHROMATOGRAPHY1车前草提取液;2丙酮沉淀的粗酶;3经CMSEPHAROSEFASTFLOW柱分离的峰4和峰5;4峰4和峰5冷冻干燥后;5过SEPHADEXG75的峰1;6过SEPHADEXG75的峰2;7MARK(从上至下分子量依次为972,664,443,290,201,143KDA)图3车前草SOD纯化前后的SDSPAGE图谱(略)FIG3SDSPAGEPATTERNOFCRUDESODPURIFIEDSODFROMPLANTAIN光谱带宽2NM;采样间隔050NM;峰1为295NM图4车前草SOD的紫外吸收光谱(略)FIG4THEULTRAVIOLETABSORPTIONSPECTRAOFPLANTAIN32酶种类的鉴定取SEPHADEXG75的峰1200ΜL分别与200ΜL蒸馏水,2MMOL/LNACN,10MMOL/LH2O2混匀后4℃放置20MIN,测定SOD活力,结果5MMOL/LH2O2使经过G75凝胶过滤的SOD活性完全失活,而1MMOL/LNACN对其活性无影响,这表明车前草中SOD为FESOD。33紫外吸收性质通过SEPHADEXG75收集到的峰1经SDSPAGE显示为单一条带,亚基分子量201KDA,对H202敏感,氰化物不敏感,冷冻干燥后呈黄褐色粉末,以上特性与文献报道[4]的FESOD一致。4讨论SOD活性测定试剂盒中所有试剂的配制均应在前一天进行,以使其充分溶解。测试前从冷藏箱拿出的试剂及样品要在室温放置30MIN后再用。试剂盒中的试剂一和试剂四是关键成分,为了减少取样误差,可以把两者先按比例10∶1混合再加到测试管中。空白对照管中的蒸馏水最好要新鲜配制,如放置时间过久等原因引起污染,均会造成对照管吸光度偏高,从而导致样品SOD活力增高。实验中用到离子交换和凝胶过滤是比较传统的方法,目前运用较多的金属离子亲和层析有吸附容量大、成本低、易于再生等特点,但缺陷在于容易发生非特异性地吸附,尤其是洗脱过程中金属离子容易脱落混入蛋白成分中,影响产品质量。利用酶底物、酶抑制剂等生物作用原理制成生物性亲和层析,其选择性远远高于金属离子亲和层析。因此通过酶-抑制剂的亲和层析方法制备高比活的车前草超氧化物歧化酶是今后研究的一个主要方向。通常SOD有很强的组织特异性,而且各种生物的不同发育阶段SOD的含量和种类也极不相同,豆芽中SOD含量明显高于其种子,辣椒的二叶期SOD含量最高[5]。应该对车前草不同的生长期,以及不同组织进行超氧化物歧化酶分离纯化并进行比活的比较,以获得最佳的提取材料。通过SEPHADEXG75收集到的峰2SOD活力弱于峰1,冷冻干燥后也呈黄褐色粉末,但亚基分子量与文献不符,是否为峰1的同工酶还需做SOD活性染色及抑制性试验等进一步确定。【参考文献】[1]国家药典委员会中华人民共和国药典一部[S]北京化学工业出版社,200546[2]李敏,程敏中药车前草化学成分与药理研究的新进展[J]现代中医药,2005,3(3)6061[3]川春美,钟秋平超氧化物歧化酶的现状研究进展[J]中国热带医学,2005,581731[4]李素霞,夏文超,袁勤生铁超氧化物歧化酶的研究进展[J]中国生化药物杂志,2002,236318[5]刘美珍超氧化物歧化酶[J]海峡药学,1998,10174

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