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成人脂肪来源间充质干细胞的分离培养与鉴定.doc

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成人脂肪来源间充质干细胞的分离培养与鉴定.doc

成人脂肪来源间充质干细胞的分离培养与鉴定作者李战强,黄友章,彭勤建,汪立川,解永学,廖丽【关键词】脂肪【关键词】成人脂肪干细胞分离培养1实验资料试剂均购自Sigma公司,荧光标记单抗购自BD公司,DMEM购自Gibco公司.成年女性48岁行吸脂术时用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织20mL.在1h内将其移至离心管内,加入等量PBS缓冲液,充分振荡后低速离心800r/min10min.反复冲洗3次后加入等量15g/LI型胶原酶.37℃水浴中充分振荡30min,再加入等量胎牛血清(FBS)中止.低速离心10min后弃去上清.将下层细胞用PBS悬浮后加入16mmol/LNH4Cl37℃水浴中10min以裂解红细胞.低速离心10min后再用PBS冲洗3次.最后将瞎胞用含100mL/LFBS10g/L青霉素的DMEM悬浮后移入培养瓶中,37℃,50mL/LCO2培养箱中孵育,48h后首次换液,弃去悬浮细胞.随后每3d换液,1wk后传代.将第3代细胞用于流式细胞仪检测.浓集细胞到109/L后按文献所述方法进行流式细胞仪检测.细胞传至第3代时将其以2107/L的细胞数分别转入各定向培养基(表1)中进行培养.诱导培养2wk后,对成脂诱导组进行油红O脂肪颗粒染色,对成骨诱导组进行碱性磷酸酶组化染色,对成软骨诱导组进行II型胶原染色,对成肌诱导组进行肌浆球蛋白组化染色.结果观察2d细胞贴壁.倒置显微镜下见细胞为大而扁平的单层细胞.有的细胞体细长,似成纤维细胞.流式细胞仪图上为单一群体细胞.免疫表型CD1069.8,CD1399.2,CD2991.0,CD5581.6,CD5998.6,CD10598.0,CD16632.1,CD140,CD450,CD3485.7,HLADR0,与国外文献一致.油红O染色、碱性磷酸酶染色、II型胶原染色阳性、肌浆球蛋白染色分别呈阳性.表1含10g/L青霉素的定向诱导培养基DMEM成份(略)2讨论脂肪来源的干细胞(adiposetissuederivedstemcells)虽然具备干细胞的一些特性,但还不能将其称为脂肪干细胞,因为其中可能含有不同分化阶段的脂肪前体细胞(preadipocyte).从这个意义上讲,将其称为脂肪基质细胞(adiposetissuederivedstromalcells)更为适合[13].目前在干细胞研究领域均公认,间充质干细胞没有特异的表面标志.免疫组化染色和流式细胞仪检测等免疫表型的结果对确认干细胞有辅助作用.而鉴定干细胞的最好方法是进行多系定向诱导,并进行相应检测以确定诱导成功.而在一些文献中以偏概全,通过少数几个CD分子的免疫组化染色的阳性结果而下结论说所分离出的细胞是干细胞是不可取的[45].本研究参照Zuk等[1]的方法进行细胞分离培养,并通过免疫表型和功能诱导2个方向的实验,取得了与文献相一致的结果,一方面说明此种方法具备稳定的可操作性,另一方面也充分说明所分离培养的脂肪基质细胞中确实含有多向分化潜能的间充质干细胞.【参考文献】[1]陈希哲,林云锋,乔鞠,等.人体脂肪基质细胞分离培养及其成骨潜能[J].实用口腔医学杂志,2004,2011215.[2]余方圆,卢世璧,袁枚,等.兔脂肪干细胞的分离培养及定向诱导为软骨细胞的实验观察[J].中国临床康复,2004,81120422043.[3]刘桂英,杨立业,郑佳坤,等.来源于脂肪组织的基质细胞向成骨细胞分化[J].实用口腔医学杂志,2003,196554557.[4]鞠晓东,娄思权,田华,等.脂肪间充质干细胞的基本生物学特性及向成骨细胞诱导分化的实验研究[J].中华实验外科杂志,2004,216654656.[5]陈光辉,王燕,李天德,等.自成人脂肪组织分离与培养间充质干细胞的实验研究[J].解放军医学杂志,2004,296510512.

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