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当归多糖的分离、纯化及分析鉴定.doc

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当归多糖的分离、纯化及分析鉴定.doc

当归多糖的分离、纯化及分析鉴定作者商澎杨铁虹贾敏梅其炳赵文明曹之宪赵德化【关键词】当归/分离和提纯关键词当归/分离和提纯当归/分析多糖摘要目的从新鲜中国当归[Angelicasinensis(Oliv)Diels]中分离纯化出多个多糖组分,并对其理化性质进行分析鉴定.方法采用水煮乙醇沉淀法从新鲜当归中提取当归总多糖AP0AP0用80g12539kg1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀得到当归多糖亚组分AP1CTAB处理后的上清用10g12539kg1H3BO3,2mol12539L1NaOH处理得到当归多糖亚组分AP2所剩上清,用乙酸处理后,再用乙醇沉淀,得到当归多糖亚组分AP3.总糖含量测定采用改良苯酚硫酸法蛋白质含量测定采用ServaBlueG染料结合法糖醛酸含量测定采用间羟基连苯法.采用新华中速滤纸纸色谱和硅胶G薄层色谱分析多糖各组分的单糖组成.高效凝胶过滤色谱和高效离子交换色谱分析多糖各组分的Mr分布和电荷性质.红外光谱法分析多糖各组分的糖苷键构成.结果AP0总糖970g12539kg1,其中糖醛酸210g12539kg1,蛋白质30g12539kg1AP1总糖970g12539kg1,其中糖醛酸172g12539kg1,蛋白质30g12539kg1AP2总糖830g12539kg1,其中糖醛酸257g12539kg1,蛋白质170g12539kg1AP3总糖970g12539kg1,其中糖醛酸86g12539kg1,蛋白质30g12539kg1.AP0,AP1,AP2和AP3主要由葡萄糖,阿拉伯糖和少量糖醛酸组成.AP0,AP1,AP2和AP3分别由5种不同分子量多糖部分组成在电荷特性上又可分别分为4个不同部分.红外光谱提示4种多糖的糖链构型为αD葡萄吡喃型.结论当归多糖的分离纯化方法有效、实用得到的AP0,AP1,AP2和AP3为具有不同理化性质的多糖组分.Keywordsangelicasinensis/isolationamppurificationangelicasinensis/analysispolysaccharidesAbstractAIMToisolateandtopurifysomepolysaccharidesfractionsfromAngelicasinensis(Oliv.)Dielsandtoanalyzeandtodeterminethecharactersofeachfraction.METHODSHotwaterextractingandethanolprecipitatingmethodwasemployedtoisolatetotalpolysaccharide(namedAP0)fromfreshrootsofAngelicasinensis.BytreatingAP0with80g12539kg1CetyltrimethylammoniumBromid(CTAB),theAP1wasobtainedfromtheprecipitate.AP2wasobtainedfromtheprecipitatebytreatingthesupernateleftfromprecedingstepwith1g12539kg1H3BO3,2mol12539LNaOH.Aftertreatingtheleftsupernatewithacetaticacidandprecipitingwithethanol,AP3wasobtained.Theamountsoftotalcarbohydrates,proteinsanduronicacidsweredeterminedwithimprovedphenolsulfuricacid,ServaBlueGdyebindingandmhydroxyldiphenylmethods,respectively.Themonosaccharidescontainedineachpolysaccharideswereanalysedbyusingpaperchromatographyandthinlayerchromatography.Highperformancegelfiltrationchromatographyandhighperformanceanionexchangechromatographywereemployedtodeterminetherelativemolecularmassesandchargecharactersofeachpolysaccharides.Infraredspectrophotometerwasusedtoanalyzethestructuresofglucosidebondsofeachsample.RESULTSFourAngelicapolysaccharideswereobtained.Thetotalcarbohydrates,uronicacidsandproteinsofeachAngelicapolysaccharideswere970g12539kg1,210g12539kg1and30g12539kg1ofAP0970g12539kg1,172g12539kg1and30g12539kg1ofAP1830g12539kg1,257g12539kg1and170g12539kg1ofAP2970g12539kg1,86g12539kg1and30g12539kg1ofAP3.ThemonosaccharidesconstituentsoftheFourAngelicapolysaccharideswereglucose,arabinoseanduronicacids.4Angelicapolysaccharideswerecomposedof5fractionswithdifferentMrand4fractionswithdifferentchargecharacters,respectively.InfraredspectrumsuggestedthattheglucosidebondsbeαDglucopy┐ranose.CONCLUSIONMethodsofpurificationandanalysiswereeffectiveandpracticalforthepreparationofAngelicapolysaccharides.4Angelicapolysaccharidesweredifferentintheirphysicochemicalcharacters.0引言多糖作为一类重要的生物大分子,具有广泛的生物学作用[1,2],但由于多糖分离纯化和结构分析等多方面的限制,大多数多糖仍作为有效部位或条件提取物进行应用.药理学研究,要求所用药物应具有均一、可控的理化性质,以保证实验结果的一致性和可比性.我们参考梅其炳等[36]和Yamada等[79]当归多糖的提取与分离方法,建立了从中国当归中分离提取出总多糖,并进一步分离纯化得到不同多糖组分的方法并对所得到的多糖组分的理化性质进行分析.1材料和方法1.1材料新鲜中国当归[Angelicasinensis(Oliv)Diels],于霜降后3d,采自甘肃省岷县城郊乡叠藏河谷地.950g12539kg1乙醇(AR),透析袋(截留Mr8000,购自华美生物工程公司),十六烷基三甲基溴化铵(AR,西安化学试剂采供站),硼酸、氢氧化钠、乙酸、浓硫酸、四硼酸钠、正丁醇、乙酸乙酯、吡啶、乙酸苯胺、邻苯二甲酸(均为AR,西安化学试剂厂生产).苯酚(AR重蒸馏,华美生物工程公司).间羟基连苯(AR,美国Sigma公司).ServaBlueG(德国ServaFeinbochemic).牛血清白蛋白(华美生物工程公司).溴化钾(GR,西安化学试剂厂).新华中速滤纸(杭州新华试纸厂).碳酸钡(CP,天津化学试剂厂).D葡萄糖(AR,西安化学试剂厂).L阿拉伯糖(AR,Sigma),D木糖(中国医药公司德国进口分装),D甘露糖(上海试剂二厂),D半乳糖(北京市化学试剂研究所),D鼠李糖(北京化学试剂公司),D葡萄糖醛酸、D半乳糖醛酸(SigmaChemical),硅胶G、羧甲基纤维素(天津化学试剂厂),FlukaDextranStandard12000,50000,80000,670000(重均相对分子质量Mr分别为11600,48600,80900,667800,瑞士Fluka),PharmaciaDextranStandardT10,T40,T70,T500和T2000(Mr分别为10000,40000,70000,500000和2000000,瑞典PharmaciaAB).EZDRY冷冻干燥机(美国FTSSystem公司),WB2000旋转蒸发仪(德国Hejdoiph公司),GL20冷冻高速离心机(湘仪TOMY联合制造),TLCG台式冷冻离心机(军事医学科学院实验仪器厂),调温电热套(河北省黄骅市电器厂),Beckman168高效液相色谱系统(美国Beckman公司),BeckmanDU600紫外可见光分光光度计(美国Beckman公司),制冰机(日本Sanyo公司),高效凝胶过滤色谱柱BiosepSEC3000(300mm7.8mm)(美国Phenomenex公司),高效阴离子交换色谱柱TSKDEAE5PW(7.5mm75mm)(美国Beckman公司),TGL.16G台式高速离心机(上海医用分析仪器厂),PE红外分光光度计(美国PE公司),DG3022A酶联免疫检测仪(华东电子管厂)1.2方法1.2.1当归总多糖AP0的分离提取新鲜当归清洗后绞碎,用950g12539kg1乙醇回流3次,每次4h.合并3次乙醇提取液,用旋转蒸发仪减压回收乙醇,可得到红色的当归精油.醇提残渣烘干后,用蒸馏水回流3次,每次4h.3次提取液合并后,减压蒸馏浓缩.浓缩液预冷后,加入3倍体积的预冷950g12539kg1乙醇,搅拌.静置后,用高速冷冻离心机收集沉淀得到粗提多糖.粗提多糖用蒸馏水溶解,4℃条件下对蒸馏水透析3d.离心去除沉淀,最终上清液经冷冻干燥得到白色冻干粉末,即AP0.1.2.2AP1,AP2和AP3分离纯化每500mL冻干前的AP0液体中加入80g12539kg1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)500mL,产生沉淀,静置12h,5000r12539min1离心10min收集沉淀.沉淀部分用350mL100g12539kg1NaCl溶解,加入4倍体积预冷的950g12539kg1乙醇,产生乳白色沉淀,收集沉淀,蒸馏水溶解后,经透析、冻干得到白色粉末状AP1.CTAB处理后的上清为无色清液,加入10g12539kg1H3BO3pH6.0,搅拌再用2mol12539L1NaOH调pH为11.0,产生乳黄色果冻状沉淀,离心收集沉淀,用20g12539kg1乙酸调pH为7.0后,用100g12539kg1NaCl溶解,溶解液中加入4倍体积的预冷950g12539kg1乙醇,产生乳白色沉淀,离心收集沉淀,蒸馏水溶解后,经透析、冻干得到白色粉末状AP2.AP2提取后的上清液用乙酸调pH为4.4,加入4倍体积的预冷950g12539kg1乙醇,4℃静置过夜,离心收集沉淀,蒸馏水溶解后,经透析、冻干得到白色粉末状AP3.1.2.3分析鉴定总糖含量测定[10,11]采用改良的苯酚硫酸法[12].糖醛酸含量测定[13,14]采用间羟基连苯法[15].蛋白质含量测定采用ServablueG染料结合法[16].重均相对分子质量及电荷特性分析详见参考文献[1720].单糖组成分析多糖样品的水解分别取AP0,AP1,AP2和AP315.8,18.0,20.0和21.7mg,分别加入浓硫酸2.0mL,溶解后移入水解管中,熔融封管,100℃烘箱中水解6h.水解后,加入固体碳酸钡中和,4000r12539min1离心,取上清液做纸色谱和薄层色谱分析.标准单糖液配制称取Rha,Xyl,Ara,Fru,Gal,Man,Glu,GluA,GalA各25mg,分别溶于0.5mL重蒸馏水中,待纸色谱和薄层色谱分析.单糖和多糖水解物的纸色谱法和薄层色谱法纸色谱分析采用新华中速滤纸(10cm30cm),展开剂为正丁醇乙酸乙酯吡啶乙酸25∶10∶10∶13显色剂苯胺邻苯二甲酸正丁醇溶液.薄层色谱法采用硅胶G自制18cm18cm薄层色谱板,展开剂、显色剂同纸色谱.红外光谱分析分别取AP0,AP1,AP2和AP3冻干样品2mg,加入200mg经干燥的KBr晶体,在红外灯照射下,在玛瑙研钵中研磨后,用压片机压片,红外分光光度计400~4000cm1中红外区扫描,测定透光率曲线.紫外光谱分析分别取AP0,AP1,AP2和AP3冻干样品,蒸馏水配制浓度约为20mg12539L1的溶液,用紫外可见光分光光度计190~400nm扫描,测定紫外区的吸收光谱.2结果2.1当归多糖组分表观性状液体状的AP0为浅米色,AP1为乳白色,AP2为浅米色,AP3为啤酒色.冻干后的AP0,AP1,AP2和AP3均为白色鳞片状结晶,极易潮解.2.2每批产量、得率和成分每批处理2700g新鲜当归,可得AP0,AP1,AP2和AP3的产量为81.9,9.8,25.9和30.1g相对于新鲜当归的提取得率为3.0,0.36,0.96和1.11.AP0~AP3中总糖含量为970,970,830和970g12539kg1糖醛酸含量为210,172,257和86g12539kg1蛋白质含量为30,30,170和30g12539kg1.2.3Mr分布和电荷特性当归多糖AP0,AP1,AP2和AP3分别由5个不同的多糖组分组成,其重均Mr(103)AP0为gt67000,43372,16755,8210和1554AP1为gt67000,gt67000,26957,5102和1917AP2为gt6700043373,26957,1971和1225AP3为gt67000,34194,16755,6472和3171.当归多糖AP0,AP1,AP2和AP3经高效阴离子交换色谱分析,分别可分为4个不同离子化程度的组分,具有不同的色谱保留时间tR,结果见AP0为3.0,9.0,12.0和15.5minAP1为4.0,13.0,20.0和23.0minAP2为4.0,13.0,16.0和19.0minAP3为3.0,7.0,15.0和20.0min.2.4单糖组成分析AP0,AP1,AP2和AP3水解液的纸色谱分别得到3个斑点,其中主要的斑点的Rf值与标准品Glu和Ara一致另一个与糖醛酸接近.薄层色谱结果与纸色谱基本一致.分别得到3个斑点,与Glu,Ara一致另一个与糖醛酸接近.2.5红外和紫外光谱分析四种当归多糖在870cm1和810cm1处没有特征吸收,不存在甘露糖苷.四种当归多糖在770cm1有D葡萄吡喃环的吸收峰,在840cm1有α型的CH平伏键,提示AP0,AP1,AP2和AP3的糖链构型可能是αD葡萄吡喃型.紫外光谱分析190~400nm紫外区四种多糖未见明显的吸收峰.3讨论采用新鲜当归提取的总多糖与本实验室以往从干品当归中提取的总多糖相比,前者颜色为纯白色,后者为乳黄色从固体形状上,前者为磷片状,后者为颗粒状前者的溶解性明显由于后者.我们借鉴Yamada等处理东当归所用的阴离子型表面活性剂CTAB法,用于中国当归多糖的分离,从总多糖AP0中分离得到3个不同的亚组分,效果比较满意.采用冷冻干燥的方法处理最终多糖成品,与以往采用的乙醇沉淀多糖,直接干燥或减压真空干燥相比,所得产物分散性好,溶解性强.当归多糖的提取方法,过程易于控制,条件易于放大,进行中试或生产.产品产率较高,总多糖可达湿重的30g12539kg1,与文献报道的干重产率85g12539kg1相比(干湿生药重量比为1∶3计),略高.从本实验研究分析结果可以看出,四种多糖具有多糖共同的光谱特性,但在理化性质上,如糖醛酸含量和蛋白质含量、分子量分布和电荷特性有所不同,这就为进一步研究多糖的组效关系提供了好的样本,可以通过在同一模型上的药效学实验,研究

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