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卫生微生物特异性显色培养基的研究与应用.pdf

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卫生微生物特异性显色培养基的研究与应用.pdf

作者简介吴清平1962,男,研究员,主要从事生物安全与食品检测研究。【综述】卫生微生物特异性显色培养基的研究与应用吴清平1,周艳红1,2,蔡芷荷311广东省微生物研究所广东省菌种保藏与应用重点实验室,广州510070;21中国科学院武汉病毒研究所,武汉430071;31广东环凯微生物科技有限公司,广州510070摘要利用传统的微生物培养及生化方法检测和鉴定卫生微生物是日常检测中的常用方法,但由于操作繁琐,需要时间较长,检测的敏感性和特异性比较局限,因此已经不能满足检测工作快和准的要求。显色培养基结合了酶与底物反应的特异性和菌落颜色的可视化信息,可以在自然环境中检测和鉴定不同的微生物个体,尤其是对混合生长的多种微生物进行检测。显色培养基被广泛应用于不同微生物群落结构检测和评价,是微生物快速检测方法中的研究热点。本文综述显色培养基在卫生微生物检测上的应用,存在的问题和发展前景。关键词特异性生化反应;卫生微生物;显色培养基;快速检测中图分类号Q93335文献标识码A文章编号10048685200501012403APPLICATIONANDRESERCHOFCHROMOGENICCULTUREMEDIAINDETECTIONANDIDENTIFICATIONOFSANI2TARYMICROORGANISMSWUQING2PING1,ZHOUYAN2HONG1,2,CAIZHI2HE311GUANGDONGINSTITUTEOFMICROBIOLOGY,GUANGDONGPROVINCIALKEYLABORATORYOFMICROBIALCULTURECOLLECTIONANDAPPLICA2TION,GUANGZHOU510070,CHINA;21WUHANINSTITUTEOFVIROLOGY,WUHAN430071,CHINA;31GUANGDONGHUANKAIMICROBIALSCITECHCO,LTD,GUANGZHOU510070,CHINA\ABSTRACT\TRADITIONALCULTUREANDBIOCHEMICALMETHODSFORDETECTIONANDIDENTIFICATIONOFSANITARYMICROORGANISMAREMOSTAP2PLICABLEINROUTINEDETECTION1BUT,THESEMETHODSCOULDN′TMEETTHENEEDSOFRAPIDANDACCURATEDETECTION,DUETOTHEIRCOMPLICAT2EDOPERATION,LONGTIMEFORIDENTIFICATION,LIMITEDSENSITIVITYANDSPECIFICITY1INCONTRAST,CHROMOGENICMEDIACOMBINEDTHESPECI2FICITYOFENZYMEANDSUBSTRATEREACTIONSWITHVISUALINFORMATIONFROMCOLONYCOLOR,ANDALLOWEDFORDETECTIONANDIDENTIFICATIONOFINDIVIDUALMICROORGANISMWITHINNATURALENVIRONMENTPARTICULARLYFORMIXEDCULTURE1ITWASUSEFULFORMANYAPPLICATIONSINDETEC2TIONANDASSESSMENTOFTHEPOPULATIONSTRUCTUREOFCOMPLEXMICROORGANISM,ANDHASBECOMEONEOFTHEHOTSPOTINRAPIDDETECTIONMETHODS1INTHISPAPER,DEVELOPMENTOFCHROMOGENICMEDIAWEREDESCRIBED,ASWELLASPROBLEMS,PITFALLSANDPERSPECTIVES1\KEYWORDS\SPECIALBIOCHEMICALREACTIONS;SANITARYMICROORGANISMS;CHROMOGENICMEDIA;RAPIDDETECTIONMETHODS人类的生产和生活环境经常被微生物污染,污染来源极其广泛\1\。当前,造成人类感染的微生物日益复杂,常见的各种病原菌的威胁不但远未消除而且还有一些新的病原菌不断出现,所以研究发展各种微生物的检测技术,尽快检测出各种具有潜在致病性的微生物,才能有效地预防和控制各种微生物感染。利用传统方法检测和鉴定微生物,需要时间较长,鉴定速度慢,且敏感性和特异性均有很大局限,不能满足工业生产上以及临床诊断中对微生物鉴定工作的需求\2\。近年来,微生物的快速检测方法有了很大发展,特别是上世纪八、九十年代,取得了很大的成绩,建立了诸如生物发光法、电阻抗法、免疫学方法和PCR方法等一系列快速检测试剂盒等简便、快速的检测方法。在一定时期一定程度上促进了快速检测方法的发展,但在使用过程中,不足之处也经常地暴露出来\3,4\。比如,利用PCR方法鉴定微生物,虽然可进行大量的快速测定,但阳性样本必须采用常规方法确认,且操作比较复杂,所需仪器设备条件较高。而显色培养基因为将微生物的分离与鉴定合二为一,具有省时省力,操作简便,敏感性和特异性都较高的优点,特别是能与常规检测方法较好地接轨而越来越受到国内外的关注。1显色培养基的基本原理微生物具有复杂多样的酶系统,胞内酶的种类及反应条件可作为微生物分类鉴定的重要依据。显色培养基即是根据酶的特征设计的对微生物进行快速检测的一种分离培养基,基本原理是在分离培养基中加入检测某些菌种的特异性酶底物,该底物为人工合成,由产色基团和微生物可代谢物质组成,通常为无色,但在特异性酶作用下游离出发色基团并显示一定颜色,直接观察菌落颜色即可对菌种做出鉴定\4\。商品化的显色培养基为干粉状,加蒸馏水溶解后,无须高压灭菌,421中国卫生检验杂志2005年1月第15卷第1期CHINESEJOURNALOFHEALTHLABORATORYTECHNOLOGY,JAN2005;VOL15NO119952005TSINGHUATONGFANGOPTICALDISCCO,LTDALLRIGHTSRESERVED煮沸即可倒平板,划线接种,置适宜温度下培养一定时间即可。显色培养基中常用的底物最先来源于生化反应中对酶动力学特征的研究,基本原理是底物被特异性酶水解,释放出发色基团,然后根据吸收峰的变化用分光光度计检测。这一特征被广泛应用于微生物学试验中。显色酶的底物通常是苯酚的衍生物,常用的有OP硝基酚、P硝基苯酚、羟基吲哚、5溴4氯3吲哚、5溴6氯3吲哚、6氯3吲哚、N甲基吲哚、5碘3吲哚等的化合物\5~8\。微生物和这些化学物质间的相互作用依发色团的不同而有很大的区别,在酶反应过程中产生的物质可以扩散到培养基中而产生预期的颜色。在选择性培养基中加入这些底物,由于不必进行菌株的亚克隆和进一步的生化反应,可以节约时间、原材料和资金投入。2显色培养基开发的进展及应用评价国外的显色培养基研究起步很早。1974年,法国的CHROMAGAR公司还未成立时,其创始人之一,DR1ALAINRAM2BACH即开发出第一个显色培养基,用于检测大肠杆菌,1979年申请了专利。此后,作为显色培养基研究开发的先驱,CHRO2MAGAR公司先后推出了检测不同微生物的显色培养基系列,包括念珠菌培养基、尿道细菌培养基、沙门菌培养基、ECC培养基、O157培养基、金黄色葡萄球菌培养基、李斯特菌培养基以及弧菌培养基。在临床诊断及生产过程的微生物检测工作中,显色培养基以其独具的优势与传统的培养基展开了竞争,从而引发了显色培养基开发和应用的热潮。瑞士的FLUKA公司、法国的BIOMRIEUX公司和德国的MERCK公司等也积极致力于开发新的微生物显色培养基,为食品、制药工业的微生物检测提供了崭新的思路。国内检测所用的显色培养基多为进口。近年来,利用显色培养基检测和鉴定微生物的报道较多,如对临床样本、食品以及水体中存在的微生物种类的检测。奥地利的著名学者M1MANAFI综述了肠杆菌科中的大肠杆菌、大肠杆菌O157∶O7、沙门菌;肠球菌、金黄色葡萄球菌等的显色培养基在近年来的发展\5~7\,但并未涉及包括念珠菌属、副溶血性弧球菌及单核细胞增生李斯特菌等主要食源性微生物显色培养基的进展。211念珠菌属显色培养基从临床标本中分离念珠菌属和其他酵母菌时,常用沙保葡萄糖琼脂,这是一种非鉴别性的培养基,只能支持多数酵母的生长,因而需要专业的检测人员从菌落及菌体形态上进行鉴定。但利用显色培养基,仅从菌落颜色就能区别多种念珠菌属微生物。21111ALBICANSIDBIOMRIEUX,FRANCE\9\在ALBICANSID琼脂平板上,白假丝酵母CANDIDAALBICANS呈现光滑的蓝色菌落。在352个白色念珠菌菌株中,330个很容易被检测出来,敏感性为9318,只有5例假阳性菌落,用传统方法进一步鉴定为热带假丝酵母CANDIDATROPICALIS,未发现假阴性菌落。该显色培养基的显色原理是加入特异性显色底物己糖胺,通过念珠菌属代谢过程中的酶水解而使菌落着色。21112CHROMAGARCANDIDACHROMAGAR,FRANCE\10\CHROMAGARCANDIDA是一种新型、选择性分离培养基,依据不同微生物产生的菌落颜色的不同,可同时鉴定白假丝酵母绿色,热带假丝酵母蓝灰色,有暗色环和克柔假丝酵母C1KRUSEI菌落粗糙扩散,中心粉红,边缘白色,敏感性超过99。与加有氯霉素和庆大霉素的沙堡琼脂相比,CHROMA2GARCANDIDA显示了较好的选择性,尤其是从混合感染的样本中分离白假丝酵母。CCILEBAOMGARTNER等比较了CHROMAGARCANDIDA与ALBICANSID分离鉴定酵母的性能,结果显示孵育24H后两者对白假丝酵母鉴别的敏感性分别为610和3710,72H后分别为9212和9316;特异性分别为100和9918。另外,在孵育48H后,CHROMAGARCANDIDA从14份热带假丝酵母中鉴别出13株菌,从12份克柔假丝酵母中鉴别出9株菌。结论这两种培养基都大大节约了人力和时间,降低了做进一步补充生化实验的必要性。该显色培养基的配方为生产厂家的专利。21113CANDIDAIDBIOMRIEUX,FRANCE\11\CANDIDAID是一种新的显色培养基,白假丝酵母在该平板上长成蓝色菌落,并且可以初步鉴定出热带假丝酵母、葡萄牙假丝酵母C1LUSITANIAE、高里假丝酵母C1GUILLIERMONDII和乳酒假丝酵母C1KEFYR等四种念珠菌,均呈现粉红色菌落。在446份真菌标本中,CANDIDAID分离的菌株多于ALBICANSID2,分别为9515和9112。与CHROMAGARCANDIDA相比,CANDIDAID显著的优势是孵育24H后,CANDIDAID更易于鉴别出白假丝酵母,敏感性分别为9618和4916。该显色培养基的配方为生产厂家的专利。21114CANDIDADIAGNOSTICAGARCDA\12\CDA是最新开发出的鉴别念珠菌属的显色培养基,它的配方以沙保葡萄糖琼脂为基础葡萄糖4010G/L,蛋白胨1010G/L,琼脂1510G/L,加入显色底物VLPAGLCNAC0132G/L。检测原理是以菌株产生的葡糖胺酶催化特异性的底物VLPAGLCNAC水解而显色。与市售常用的显色培养基CHROMAGARCANDIDA和CANDIDAID相比,CDA具有以下优势鉴别白假丝酵母和杜氏假丝酵母C1DUBLINIENSIS两种菌混合感染的敏感性和特异性,CDA均为100,而CHROMAGARCANDIDA分别为9716和100,CANDIDAID分别为100和9618;鉴别热带假丝酵母和乳酒假丝酵母混合感染的敏感性和特异性,CDA均为100,而CHROMAGARCANDIDA分别为7217和9811,CANDIDAID只能鉴别包括热带假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、高里假丝酵母和乳酒假丝酵母的范围较广的混合感染的群体,敏感性和特异性分别为9417和9318;再者利用CDA检测时菌落的颜色很确定有红点的白色菌落、粉红色或白色,不需要对颜色做进一步估测。212副溶血性弧菌VIBRIOPARAHAEMOLYTICUS显色培养基\13\副溶血性弧菌是重要的食源性致病菌,常用的检测方法是先用碱性蛋白胨水进行选择性增菌,然后在TCBS琼脂上富集培养、分离。YUKIKOHARALKUDO等研究出敏感性和精确性都优于传统方法的两步增菌法,即首先在胰酪胨盐大豆肉汤SALTTRYPTICASESOYBROTH中非选择性增菌,然后在多粘菌素盐肉汤SALTPOLYMYXINBROTH中选择性增菌,最后涂布在CHROMAGARVIBRIOCV显色平板上,通过长出的紫色菌落来检出副溶血性弧菌。CV由CHROMAGAR公司开发,通过Β半乳糖苷酶水解特异性底物而显色。213单核细胞增生李斯特菌LISTERIAMONOCYTOGENES\14\单核细胞增生李斯特菌可以从食品中分离出的食源性致521中国卫生检验杂志2005年1月第15卷第1期CHINESEJOURNALOFHEALTHLABORATORYTECHNOLOGY,JAN2005;VOL15NO119952005TSINGHUATONGFANGOPTICALDISCCO,LTDALLRIGHTSRESERVED病菌。用传统方法检出需5~8D,但利用显色培养基CHROMAGARTMLISTERIA需4D,并且阴性标本的检出只需2D。与传统的ISO112901方法相比,利用显色培养基简单、快速,且无假阳性结果。单核细胞增生李斯特菌在显色培养基上长出带有光圈的蓝色菌落。该显色培养基的配方为生产厂家的专利。3显色培养基在应用中存在的问题和今后展望国内外的许多专家就显色培养基的应用作了研究和评价,并与传统的培养基比较,一致认为显色培养基具有较高的特异性和灵敏度,但是在检测工作中也出现一些问题,比如检测混合感染的微生物时,会出现一定比例的假阳性或假阴性,从而干扰目标微生物的检出,降低了显色培养基的敏感性和特异性;另外,在某些显色培养基的利用中,可能会出现不同的菌种呈现相似的颜色或者同一种微生物呈现不同的颜色,需要辅助观察,如菌落形态、显微检查或传统的生化实验才能对菌株作初步鉴定,这样一方面需要专业人员,另一方面又延长了检测时间;第三,显色培养基中加入一些抑制杂菌生长的物质,高浓度时可能会抑制目标菌的生长;第四,显色培养基在涂板后,孵育的不同时间菌落呈现的颜色不同,要求检测人员把握好时机,方可提高阳性菌的检出率;最后,目前针对某个菌属微生物特异检测的显色培养基,只能检出该属中的常见种,对其他少见的种还不能鉴别。在显色培养基的研究及开发中,机理方面的研究即微生物特异性生化反应机制的研究可能是未来发展的方向。对微生物特异性生化反应机制研究的深入,将会促进新型显色培养基的开发,在特异性和敏感性方面有长足的进步。鉴于已经商品化的显色培养基在使用过程中存在的问题,对现有的显色培养基进行改造或开发新的显色培养基将是进一步发展的方向,如在同一块平板上同时检测和鉴定较多种类的致病菌的存在。另外,在显色培养基开发过程中应考虑到解决菌落颜色易识别、不同种微生物差异较大以及稳定性等问题。最后,现有的显色培养基多为粉末状或预制成的平板,后者使用起来较为方便,但成本较高,也不便携带,因此,将新开发的显色培养基制成轻便试纸,并用胶状物质粘在适宜的膜上开发成检测卡将是一个发展方向。参考文献\1\郁庆福,主编1现代卫生微生物学\M\1北京人民卫生出版社,19951\2\夏晴1微生物的快速检测\J\1日用化学品科学增刊,1999,1861881\3\朱光富1快速微生物检测试剂盒和快速检测仪\J\1现代商检科技,1997,159631\4\农生洲1微生物病原体快速检测技术进展\J\1AMTHOLGYOFMEDICINE,2001,205205221\5\MANAFIM,KNEIFELW1ANDBASCOMB,S1FLUOROGENICANDCHROMOGENICSUBSTRATESUSEDINBACTERIALDIAGNOSTICS\J\1MICROBIAL1REV,1991,553353481\6\MANAFIM1FLUROGENICANDCHROMOGENICENZYMESUBSTRATESINCULTUREMEDIAANDIDENTIFICATIONTESTS\J\1INTJFOODMICROBIOL,1996,3145581\7\MANAFIM1OECDWORKSHOPMOLECULARMETHODSFORSAFEDRINKINGWATER1INTERLAKEN’981\8\MANAFIM1NEWDEVELOPMENTSINCHROMOGENICANDFLUROGENICCULTUREMEDIA\J\1INTJFOODMICROBIOL,2000,602052181\9\ROUSSELLEP,FREYDIEREA,COUILLEROTP1RAPIDIDENTIFICATIONOFCANDIDAALBICANSBYUSINGALBICANSIDANDFLUROPLATEAGARPLATES\J\1JCLINMI2CROBIOL,1994,32303430361\10\BAUMGARTNERC,FREYDIEREA,GILLEY1DIRECTIDENTIFICATIONANDRECOG2NITIONOFYEASTSPECIESFROMCLINICALMATERIALBYUSINGALBICANSIDANDCHROMAGARCANDIDAPLATES\J\,1996,344544501\11\WILLINGERB,HILLOWOTHC,SELITSCHB1PERFORMANCEOFCANDIDAID,ANEWCHROMOGENICMEDIUMFORPRESUMPTIVEIDENTIFICATIONOFCANDIDASPECIES,INCOMPARISIONTOCHROMAGARCANDIDA\J\1JCLINMICROBI2OL,2001,39379337951\12\VENITIAM,COOKERJ,MILES,ETAL1NEWCHROMOGENICAGARMEDIUMFORTHEIDENFICATIONOFCANDIDASPP\J\1APPLENVIRONMICROBIOL,2002,68362236271\13\YUKIKOHARAKUDO,TOKUHIRONISHINA,HIROSHINAKAGAWA1IM2PROVEDMETHODFORDETECTIONOFVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSINSEEFOOD\J\1APPLENVIRONMICROBIOL,2001,67581958231\14\CHROMAGARTMLISTERIAMETHODFORDETECTIONLISTERIAMONOCYTO2GENES1MURIELCOIGNARD,ASEPTSAS,LAVAL,FRANCE1收稿日期200409252005年举办国家级继续教育的通知我刊2005年将举办“国家医学继续教育培训”,并在中国卫生检验杂志上开设“医学继续教育函授”,望广大卫生检验工作者积极参加。有关事项如下1每期刊发一篇医学继续教育专题讲座,根据讲座内容给学员出2道思考题。2学员必须对所留思考题认真作答,并在规定时间内寄回答案。3完成全年思考题者为学业期满。经考核合格,可获得中华预防医学会颁发的国家一类学分12分证书。4报名即日起开始报名,欲参加者请通过邮局将180元费用包括报名注册费、全年杂志订阅费汇至“北京市2086208信箱。邮政编码100035”。汇款时请在附言栏内注明继续教育\,写清单位、地址、姓名。我刊在收到费用后,即注册并将发票及学员证用挂号信一并寄给学员。621中国卫生检验杂志2005年1月第15卷第1期CHINESEJOURNALOFHEALTHLABORATORYTECHNOLOGY,JAN2005;VOL15NO119952005TSINGHUATONGFANGOPTICALDISCCO,LTDALLRIGHTSRESERVED

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