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胃癌中医证型相关基因的表达谱.pdf

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胃癌中医证型相关基因的表达谱.pdf

WorldChinJDigestol2003September11913181321世界华人消化杂志ISSN10093079CN141260/R2003年版权归世界胃肠病学杂志社P.O.Box2345Beijing100023,ChinaFax861085381893Emailwcjdwjgnet.comwww.wjgnet.com胃癌GASTRICCANCER胃癌中医证型相关基因的表达谱刘莺,李俊军,朱文锋,刘平刘莺,刘平,上海中医药大学肝病研究所上海市200032李俊军,湖南肿瘤医院病理科湖南省长沙市410007朱文锋,湖南中医学院中医诊断研究所湖南省长沙市410007刘莺,女,19611107生,湖南省宁乡人汉族,上海中医药大学博士后,主要从事中医病证规范化研究.项目负责人刘莺,200032,上海市零陵路530号,上海中医药大学肝病研究所.liuluowasohu.com电话02154231169传真02164036889收稿日期20021224接受日期20030108GastriccancerrelatedgeneexpressionspectrumindiseasepatternoftraditionalChinesemedicineYingLiu,JunJunLi,WenFengZhu,PingLiuYingLiu,PingLiu,InstituteofLiverDiseases,ShanghaiUniversityofTraditionlChineseMedicine,Shanghai200032,ChinaJunJunLi,HunanHospitalofTumorDiseases,Changsha410007,HunanProvince,ChinaWenFengZhu,InstituteofDiagnosticsofTraditionalChineseMedicine,Changsha410007,HunanProvince,ChinaCorrespondencetoYingLiu,530LinglingRoad,Shanghai,InstituteofLiverDiseases,ShanghaiUniversityofTraditionlChineseMedicine,Shanghai200032,China.liuluowasohu.comReceived20030306Accepted20030328AbstractAIMTofinddifferenceingeneexpressionpedigreeofgastriccarcinomatissueanddifferentsyndrome,anditssignificanceintheexplorationofthesyndrometypanddiagnosisofgastriccarcinoma,withgenediagnosisaswellastheuseofdrugsinitstreatment.METHODSThegeneexpressionintwoTCMsyndrometypesofgastriccarcinomaduetointernalstagnancyofpathogenicheatandstagnancyofqiandbloodstasis,respectively,including4humangastriccarcinomatissuesandnormalembryostomachtissue,wasanalyzedbyusing4096piecesofhumanfulllengthgenicCDNAexpressionCMOSchiptechnology.RESULTSThegeneexpressioninthetwoTCMsyndrometypesofgastriccarcinomawasdecreasedintheirimmuneassociatedgenes,butincreasedincancerassociatedgenes.Geneexpressionintheinteriorstagnancyoftoxicheatshowedthatthebodyresistancewasnotweakened,suggestingthattherewasnodeficiencyofqiandstagnancyofbloodstasisCONCLUSIONThechangeingeneexpressionofgastriccancerisidentical,butthegeneexpressionspectrumisdifferentindifferenttypesofTCMsyndromes.LiuY,LiJJ,ZhuWF,LiuP.GastriccancerrelatedgeneexpressionspectrumindiseasepatternoftraditionalChinesemedicine.ShijieHuarenXiaohuaZazhi200311913181321摘要目的寻找不同胃癌证型组织中的相关基因表达谱差异表达对研究胃癌证型实质进行探讨胃癌的中医证的基因诊断及指导临床用药有重大的意义.方法我们运用含有4096条人类全长基因的cDNA表达芯片技术对胃癌中医证型邪热内蕴证和气滞血瘀证共4例胃癌组织及胎胃正常组织基因表达进行了分析.结果两证型都有免疫相关基因的下降也有癌基因的上调但热毒内蕴亚型基因表达提示了正气未虚尚有防御能力如nm23基因增高P18基因表达增高而气虚夹瘀亚型中则无此改变.结论胃癌患者的基因表达既有相同表达改变也有不同中医证型的基因谱表达改变也不相同基因表达谱可为中医的证型提供科学依据.刘莺,李俊军,朱文锋,刘平.胃癌中医证型相关基因的表达谱.世界华人消化杂志200311913181321http//www.wjgnet.com/10093079/11/1318.asp0引言人类基因组计划的实现给中医现代化带来了新的机遇1.基因组学研究方法与中医学的整体观辨证观有许多相似之处一种疾病可能由于多个基因改变所致而同一种基因有不同表达状态可能导致多种疾病2反映出基因组学与中医学两个学科在思维方法上的趋近特征为中医病证实质性突破提供了条件.肿瘤在不同的个体不同的病理类型中其生长浸润转移是不同的这一点与中医证的形成有某些相通之处3.他们都是依赖有特异编码的基因产物起作用正是由于这种基因的微细异常决定其生物行为出现极大的变化4.因此运用基因芯片技术寻找不同证型胃癌组织中的相关基因表达谱差异表达对研究胃癌证型的实质胃癌的中医证的基因诊断及指导临床用药有重大的意义.1材料和方法1.1材料上海博星公司的基因表达谱芯片上一共有4096个点其中设有几个阴性对照水稻U2RNA基因8个点HCV外壳蛋白基因8个点空白点样液32个点.芯片所用的4000个靶基因cDNA克隆来自博星公司及合作伙伴.以通用引物进行PCR扩增PCR引物为10003000bp少数例外PCR反应及产物提纯采用标准方法5通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物质量靶基因溶解于3SSC溶液中用Cartesian公司的7500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样点样玻片经水合2h室温干燥30minUV交联能量设定65mI/cm再分别用2g/LSDS水及2g/L硼氢化钠溶液处理10min晾干备用.胃癌组织标本4例是湖南省肿瘤医院200103行标准胃癌切除手术切除的胃癌标本.例1男23岁.胃癌组织类型为低分化腺癌浸入胃壁全层有近处淋巴转移.例2男35岁.胃癌组织类型为中分化腺癌浸入胃壁全层有近处淋巴转移.例3女30岁.胃癌组织类型为低分化腺癌浸入胃壁深肌层有近处淋巴转移.例4男63岁.胃癌组织类型为低分化腺癌部份黏液癌浸入胃壁全层有近处淋巴转移.经对胃癌术前患者症状进行聚类与主成分分析显示例12为邪热内蕴证中的热毒内蕴兼气虚亚型34为气滞血瘀证中的气虚夹瘀亚型.对照组取自发育正常的流产胎胃.分别于标本切除后立即液氮保存.1.2方法总RNA抽提方法参考ChomczynskietalAnalbiGhein1987163156提出的步法加以改进将液氮保存的胃癌组织和胎胃放在100mm陶瓷碾钵内分别彻底碾碎成粉末加入溶液D和10g/L巯基乙醇匀浆成溶液离心后上清液经11的酸性酚氯仿两次抽提后再经NaAc和51酸性酚氯仿抽提再经等体积异丙醇沉淀离心后用MiliQii溶解沉淀紫外分析用LiCl沉淀方法纯化后紫外分析及电泳检测显示获得了高质量的纯净mRNA.用OligotexMrnaQuagen公司纯化mRNA参照SchenaR方法转录标记cDNA并纯化用Cy3dUTP标记正常组织mRNA用Cy5dUTP标记癌组织mRNA.乙醇沉淀后溶解在20µl5SSC2g/LSDS杂交液中.将cDNA微矩阵和杂交探针分别在95水浴中变性5min将探针加在cDNA微矩阵上用玻片封片置于60杂交1517h然后揭开玻片分别用2SSC2g/LSDS1g/LSSC2g/LSDS1g/LSSC洗涤10min室温晾干.芯片的扫描来自GeneralScanning公司的ScanArray3000扫描仪分析软件为Biodoscovery公司的ImaGene3.0和博星公司开发的ArrayGene1.0.统计学处理40个管家基因作参照对原始数据进行标准化处理剔除Cy3和Cy5中信号强度均小于400的基因表达数据.基因显著性差异表达的判定标准为Ratio大于2或Ratio小于0.5RatioCy5/Cy3.同时要求筛选出的基因数据在所有样本中均能重复2结果2.1基因表达图谱图14为基因表达谱的散点图每一个点都代表一个基因X轴和Y轴分别以Cy3的荧光强度值前景值背景值和Cy514荧光强度值为坐标每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号数据若为红色则代表X值与Y值的比值在0.52.0之间基本属非特异表达数据若为黄色则代表X值与Y值的比值在0.52.0之外该点很可能就是表达差异基因.图1例1病理组织与正常组织散点图.图2例2号病理组织与正常组织散点图.图3例3病理组织与正常组织散点图.图4例4病理组织与正常组织散点图.图58为表达谱芯片双色荧光扫描图像分别代表了癌变组织中和正常组织中基因的表达.对于某一点的两种叠加荧光信号如果Cy3信号较强该点显绿色下调趋势如果Cy5信号较强该点显红色上调趋势如果强度相似即呈黄色.刘莺,等.胃癌中医证型相关基因的表达谱1319图5例1基因芯片双色重叠扫描图.图6例2基因芯片双色重叠扫描图.图7例3基因芯片双色重叠扫描图.图8例4基因芯片双色重叠扫描图.2.2胃癌组织的基因表达差异所选4例原发胃癌标本以胎胃为正常对照筛选与胃癌组织中表达改变有差异的基因.在进入研究的4096条基因中发现表达差异相差两倍以上的基因有80条1.95其中表达上调的28条下调的52条其中包括肿瘤基因及肿瘤相关基因为细胞周期蛋白蛋白转录合成和转录因子细胞受体免疫因子信号传导和传递蛋白代谢相关基因蛋白翻译合成基因发育基因.2.3两证型基因表达差异两证型基因表达除上述80条基因与正常胃比较表达有显著性差异外两亚型之间比较表达有差异的基因有167条其中热毒内蕴兼气虚亚型中表达差异有71条上调者35条下调者36条包括了4条癌基因或抑癌基因2升2降5条细胞周期蛋类基因2升3降1条离子通道和输蛋白降5条外压反应蛋白2升3降3条DNA结合转录因子1升2降2条细胞受体降9条免疫相关基因8升1降21条细胞信号的传递蛋白9升12降12条代谢相关基因11升1降10条蛋白翻译合成蛋白5升5降1发育相关基因降10条其他基因.根据已查的文献上调的基因有干扰素相关基因nm23CD24P18下调基因的有细胞周期素EIV型胶原酶等.气虚兼瘀血亚型表达有差异的基因有96条上调57条下调39条包括了6条癌基因或抑癌基因3升3降8条细胞周期蛋类基因5升3降3条离子通道和输蛋白2升1降12条外压反应蛋白3升9降2条细胞凋亡相关基因升1条DNA合成修复重组蛋白升6条DNA结合转录因子5升1降3条细胞受体1升2降5条免疫相关基因4升1降14条细胞信号的传递蛋白4升10降17条代谢相关基因13升4降8条蛋白翻译合成蛋白升4发育相关基因1降3升23条其他基因.据所查文献有CD53M15796等增高下调的有NM006096等.3讨论我们所选病例中都有不同程度的气虚和毒邪两因素因此在胃癌组织中既有代谢相关基因X51405的下降免疫相关因子如人类免疫G蛋白的下降表明了胃癌的发生与自身免疫力的下降相关同时也有肿瘤转录相关基因M97935的增高P21Ras69在信号传递中起作用这种已失调节活性的效应分子的长期剌激就导致细胞的无限增生而显示癌化现象.组织中的P21ras突变都提示癌基因突变.这些变化显示了胃癌患者既有脏腑功能下降又有癌毒内蕴呈发展趋势.热毒内蕴兼气虚亚型的基因表达特点nm23基因增高.nm231017是一种与肿瘤转移抑制有关的基因.其基因编码产物为核苷酸激酶NDPK参与体内三磷酸核苷的生成通过影响微管聚合状态及G蛋白介导的信号转导通路而调节细胞代谢在肿瘤细胞的增生分化侵袭及转移过程起重要作用.因此检测nm23基因有无异常表达降低对胃癌有无转移及预判断具有重要意义.P18基因表达增高.P18是一种多肿瘤抑制蛋白基因1821.主要作用CDF4/CDK6两种CDK的蛋白激酶活性具有特异性的抑制作用而细胞周期素依赖性蛋白激酶CDF处于细胞周期的中心有关CDK分子的不同位点的磷酸化修饰决定了CDK蛋白的活性并决定了一系列与基因表达有关的蛋白的磷酸化修饰状态从而对细胞周期具有调节机制.因此P18蛋白也是细胞周期中的一个重要的有抑制作用的蛋白质.免疫相关基因增高.有白介素受体mRNA干扰素诱导的927mRNA和56ku蛋白质人类B细胞促进因子增高.有实验证明这些细胞因子白介素干扰素诱导人类B细胞促进因子增高能抑制和杀伤肿瘤细胞生长其机制可能还与促进肿瘤抗原表达有利于机体某些免疫活性细胞识别黏附和杀伤有关.表明本型患者正气未虚尚有抗邪个出之势.细胞周期素EcyclinE减少2230.过表达时具有一定的促进细胞进入到S期的作用而异源性细胞周期素EcyclinE足以诱导分裂后处于G1期的细胞进行另一轮的DNA复制以及分裂过程同时异源性表达的细胞周期素E也足以诱导细胞周期素A和B的积累而这两种细胞周期素又是有丝分裂期所必须的.细胞周期1320ISSN10093079CN141260/R世界华人消化杂志2003年9月15日第11卷第9期5678素EcyclinE促进细胞周期素A和B积累的机制不是促进这两种细胞周期素的转录可能是抑制了细胞周期素降解机制使这两种细胞周期素的蛋白更为稳定.下降则使细胞进入G1期及DNA复制过程受阻.IV型胶原酶下降.IV型胶原酶是其底膜结构中最为重要的组成.肿瘤细胞要通过其底膜进行转移必须分泌这种酶以破坏其底膜的结构因而推测肿瘤细胞转移与IV型胶原酶表达水平与活性有关.当IV型胶原酶下降时肿瘤的转移受阻.通过对表达有显著差异的基因功能的认识可以看到在热毒内蕴兼气虚证中由于正气未衰尚有防御功能因此抑癌基因和有抑癌作用的基因表达增强nm23基因P18基因干扰素相关基因具有肿瘤生长和转移作用的基因下降细胞周期素EIV型胶原酶.抗癌因素强于癌毒扩散因素.在临床上所表现的证型以实为主病变较轻.气虚兼瘀血型的基因谱表达特点CD53基因未成熟瘤克隆转录子周期蛋白基因D型细胞周期蛋白互作蛋白1等表达增强.这些基因在胃癌发生发展过程中的作用机制有待于进一步研究.但热毒内蕴兼气虚亚型中基因表达特点在本亚型不具备.总之胃癌中医证型形成机制与基因表达有关因此阐明基因与证之间的联系对认识疾病的发生机制预测疾病的转归无疑会发挥重要作用.研究基因表达谱改变与证型多样性之间的联系是一个崭新的领域也是研究中医证实质的关键所在应引起我们足够的重视.4参考文献1余伯阳,严永清.浅析现代生物学研究方法及与中医药现代化的关系.世界科学技术中药现代化思路与方法2001345492张昱,谢雁鸣.后基因组时代中医药研究思路方法新探.中医药学刊2001194264273王忠,王阶,王永炎.后基因组时代中医证候组学研究的思考.中国中西医结合杂志2001216216224YasuiW,OueN,KuraokaK,NakayamaH.Moleculardiagnosisofgastriccancerpresentandfuture.GastricCancer200141131215GolubTR,SlonimDK,TamayoP,HuardC,GaasenbeekM,MesirovJP,CollerH,LohML,DowningJR,CaligiuriMA,BloomfieldCD,LanderES.Molecularclassificationofcancerclassdiscoveryandclasspredictionbygeneexpressionmonitoring.Science199926865315376GoJH,YangWI.Expressionsofp53andp21inprimarygastriclymphomas.JKoreanMedSci2001167317357NodaH,MaeharaY,IrieK,KakejiY,YonemuraT,SugimachiK.Increasedproliferativeactivitycausedbylossofp21WAF1/CIP1expressionanditsclinicalsignificanceinpatientswithearlystagegastriccarcinoma.Cancer200294210721128LiuXP,KawauchiS,OgaA,SuehiroY,TsushimiK,TsushimiM,SasakiK.Combinedexaminationofp27Kip1,p21Waf1/Cip1andp53expressionallowspreciseestimationofprognosisinpatientswithgastriccarcinoma.Histopathology2001396036109LiuXP,KawauchiS,OgaA,SuehiroY,TsushimiK,TsushimiM,SasakiK.GenomicstructureofthehumanbetaPIXgeneanditsalterationingastriccancer.CancerLett200217720320810TeradaR,YasutakeT,NakamuraS,HisamatsuT,SawaiT,YamaguchiH,NakagoeT,AyabeH,TagawaY.Clinicalsignificanceofnm23expressionandchromosome17numericalaberrationsinprimarygastriccancer.MedOncol20021923924811JiSQ,HuaYW,ZhuangJ,GaoY,KongY,HanSL,ShaoYF.SignificanceofCOX2,p53,proliferatingcellnuclearantigenandnm23expressionsingastriccanceranditsbehavior.AiZheng20022161962412NesiG,PalliD,PerniceLM,SaievaC,PaglieraniM,KroningKC,CatarziS,RubioCA,AmorosiA.Expressionofnm23geneingastriccancerisassociatedwithapoor5yearsurvival.AnticancerRes2001213643364913WangCS,LinKH,HsuYC.AlterationsofthyroidhormonereceptoralphagenefrequencyandassociationwithNm23proteinexpressionandmetastasisingastriccancer.CancerLett200217512112714IizukaN,TangokuA,HazamaS,YoshinoS,MoriN,OkaM.Nm23H1geneasamolecularswitchbetweenthefreefloatingandadherentstatesofgastriccancercells.CancerLett2001174657115LeeJH,KohJT,ShinBA,AhnKY,RohJH,KimYJ,KimKK.Comparativestudyofangiostaticandantiinvasivegeneexpressionsasprognosticfactorsingastriccancer.IntJOncol20011835536116HsuNY,ChowKC,ChenWJ,LinCC,ChouFF,ChenCL.Expressionofnm23intheprimarytumorandthemetastaticregionallymphnodesofpatientswithgastriccardiaccancer.ClinCancerRes199951752175717YooCH,NohSH,KimH,LeeHY,MinJS.PrognosticsignificanceofCD44andnm23expressioninpatientswithstageIIandstageIIIAgastriccarcinoma.JSurgOncol199971222818BaiF,PeiXH,GodfreyVL,XiongY.Haploinsufficiencyofp18INK4csensitizesmicetocarcinogeninducedtumorigenesis.MolCellBiol2003231269127719KimDS,FroelickGJ,PalmiterRD.Dopaminedependentdesensitizationofdopaminergicsignalinginthedevelopingmousestriatum.JNeurosci2002229841984920LasakJM,WellingDB,AkhmametyevaEM,SalloumM,ChangLS.Retinoblastomacyclindependentkinasepathwayderegulationinvestibularschwannomas.Laryngoscope20021121555156121SchonA,FingerhutC,HessWR.ConservedandvariabledomainswithindivergentrnasePRNAgenesequencesofProchlorococcusstrains.IntJSystEvolMicrobiol2002521383138922ChettyR,SittiCW.CyclinEimmunoexpressioningastriccancerdoesnotcorrelatewithclinicopathologicalparameters.Histopathology200342666923YaoYL,XuB,SongYG,ZhangWD.OverexpressionofcyclinEinMongoliangerbilwithHelicobacterpyloriinducedgastricprecancerosis.WorldJGastroenterol20028606324FerreriAJ,PonzoniM,PruneriG,FreschiM,RossiR,DellOroS,B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