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参黄冲剂对衰老患者P16 基因mRNA 表达及临床疗效的影响.doc

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参黄冲剂对衰老患者P16 基因mRNA 表达及临床疗效的影响.doc

参黄冲剂对衰老患者P16基因mRNA表达及临床疗效的影响韩旭李七一郭宏敏赖仁胜艾炳蔚苑志军孙云霞张彪尤峰屠浩明江苏省中医院(中国210029)中图分类号R22.34文献标识码A文章编号1818-0086(2012)01摘要目的应用基因测序技术,通过观察参黄冲剂对衰老患者P16基因mRNA定量表达等相关内环境指标影响与个体反应差异的相关性,评价参黄冲剂在延缓衰老方面的作用和临床疗效。方法采用随机、单盲、对照研究方法,共选择60例符合条件的衰老患者纳入研究及统计分析。所有患者被随机分为参黄冲剂治疗组和对照治疗组,每组30人。参黄冲剂组进行常规治疗基础上加用参黄冲剂治疗(江苏省中医院协定处方),每次10ɡ,每日3次。对照组进行常规系统治疗,并给予甲磺酸双氢麦角毒碱片,每次1mg,每日3次。各组均连续服药8周为1个疗程,观察时间为1个疗程。结果衰老患者肾阴虚、肾阳虚2种证型P16基因的序列特征未见突变改变。参黄冲剂组治疗后衰老患者P16基因mRNA扩增曲线起始循环数(ct值)明显变大(p0.05)参黄冲剂组治疗后肾阴虚、肾阳虚两种证型P16基因mRNA扩增曲线起始循环数(ct值)未见明显差异(p0.05)。参黄冲剂组与对照组在治疗前的衰老患者P16基因mRNA定量表达无统计学意义p0.05,二者之间具有可比性在治疗后两组比较具有统计学意义p0.05)。1.2两组年龄对比参黄冲剂治疗组年龄最高80岁,最低62岁对照组年龄最高78岁,最低60岁两组年龄分布没有显著性差异(p0.05)。1.3两组证型对比参黄冲剂治疗组肾阴虚型14例,肾阳虚型16例对照组肾阴虚型12例,肾阳虚型18例两组证型分布没有显著性差异(p0.05)。两组在性别、年龄、证型分布上皆具有可比性。2诊断标准和症状量化分级标准2.1衰老的辨证诊断标准参照中医虚证参考标准1制定,分为肾阳虚证、肾阴虚证2个证型。肾阳虚证腰膝酸软、性欲减退、畏寒肢冷、夜尿频多、下肢浮肿、腰膝酸软、精神萎靡、动则气短,舌质淡,脉弱。肾阴虚证头目眩晕、视力模糊、耳鸣或耳聋、腰膝酸软、身疲乏力、烦热汗出、咽干便燥、脱发或发白、失眠健忘、性功能减退、尿后余沥或不禁,齿摇或齿落、肤燥身痒、常易外感、震颤肢麻,舌质红,脉细。2.2衰老症状量化分级标准参照延缓衰老中药的筛选规程和临床观察规范中有关肾虚评分部分2制定。重度主动说出或显著、持续出现,为3分中度时重时轻,间断出现,为2分轻度症状较轻或偶尔出现,为1分无症状为0分。舌脉中任何一项出现者均为3分。用治疗前后衰老积分值的变化来反映衰老程度的变化。针对衰老症状的严重程度和动态变化分级记分。3治疗方案治疗组常规治疗基础上加用参黄冲剂(江苏省中医院协定处方,江苏江阴天江制药有限公司制成中药配方颗粒),每次10ɡ,每日3次。对照组常规治疗的基础上给予甲磺酸双氢麦角毒碱片(瑞士诺华制药有限公司生产),每次1mg,每日3次。各组均连续服药8周为1个疗程,每7天复诊一次。观察时间为1个疗程。4疗效评价标准根据中医证候的临床研究指导原则证候疗效判定标准3,采用积分法评价中医证候疗效。疗前积分疗后积分疗效指数(N)100疗前积分①显效症状积分下降2/3以上N≥70。②有效症状积分量降1/32/3N≥30<70。③无效未能达到上述有效标准,N<30。5观察项目及指标检测方法5.1观察项目①临床指标病史、症状、体征、舌质、脉象。②治疗前病人随机检测P16基因的序列突变特征。③各组治疗前后P16基因mRNA定量表达的变化。④各组治疗前后临床疗效和症状积分。5.2指标检测及观察方法5.2.1P16基因测定采用基因测序方法。①标本收集抽取患者静脉血2ml,试管内含抗凝剂(肝素或EDTA)②模板DNA的提取用Omega公司血液基因组DNA提取试剂盒,按说明提取DNA,应用琼脂糖凝胶电泳技术检测DNA纯度,再用eppendorf核酸定量仪测定DNA浓度(260nm吸光率大于0.05以上,DNA含量大于2.0ug/ul,吸光率A260/A280比值1.61.8之间,320nm波长处吸光率接近为0)③PCR扩增引物的设计与合成根据NCBI相关文献提供的研究结果,确定候选的基因片段,利用genebank上提供的序列设计引物,由上海生物合成.序列为P1(上游引物)5,GAATAAGTTACGGTCGGAG3,P2(下游引物)5,CGGTGACTGATGATCTAAG3,。PCR产物片段长度401bp。④PCR反应体系(总体系20ul)10PCRBuffer(含15mMMgCL2)2ul,HotStarTaqDNAPolymerase(QIAGEN公司)0.2ul,5QSolution4ul,dNTPmi(10mMofeach)2ul,Primer11ul,Primer21ul,模版DNA1ul,Distilledwater8.8ul。⑤PCR反应条件置ABIq700型扩增仪中95℃预变性15min,用TouchdownPCR,94。C变50sec,63。C58。C退火1min(0.5。C/1min,72。C延伸1min,共循环10次,94。C变性50sec,57。C退火1min,共循环30次,最后于72。C延伸10min)。PCR产物纯化用1.5琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带,根据Axygen公司提供的PCR纯化试剂盒,对PCR产物过柱纯化后,进行测序反应。⑥测序反应反应体系2.8ulBigDye+1.6ulBigDyeSeqBuffer+0.3ul引物1ulPCR纯化产物6.3ulddH2O。测序热循环条件96。C,10sec→(96。C10sec→50。C5sec→60。C4min)25个循环→60。C,4min→4。C保温。测序反应后纯化每管加入1ul125mMEDT到管底,再加入1ul3MNaAc→每管加入100ul100乙醇,封口膜封严密,震荡混匀4次,室温放置15min→4000rpm离心45min,马上倒置96孔→1200rpm离心1min→重复第4步骤1次→室温挥发净酒精,加入10ulHiDiFormamide溶解DNA→样品在95。C变性4min,迅速置冰中冷却4min。基因测序电泳前,在数据采集软件(Datecollection2.0)中选择正确的运行模块和分析模块。样品制备,上样至3100Avant遗传分析仪进行电泳。Datecollection软件自动进行数据处理和分析。结果分析将测序结果用DNAsequencinganalysis5.1自动分析原始测序数据,获得测序电泳图和序列。将样品序列用DNAseqcape与标准序列进行比对,观察样本基因序列的改变。5.2.2P16基因mRNA表达检测实时荧光定量PCR技术检测P16基因mRNA表达。①提取血液中总RNA。②总RNA的浓度及纯度鉴定。③反转录反应反应体系及反应程序Gdna1μl,总RNA1.0μg,混匀,42℃孵育2min,primer0.5μl,RTose0.5μl,RT10Buffer2μl,加水至总体积10μl。42℃30min95℃5min20℃保存。④RealTime反应SYBR法反应体系cDNARNA反转录所得cDNA1µL,SYBRmix2.5µL,上下游primer各0.25μl,H2O1µL,总体积5µL。PCR循环参数50℃2min→95℃10min→92℃15sec→60℃1min40个循环。ABI7900荧光定量PCR仪扩增、软件操作反应体系,分析实验数据。6统计分析的内容和方法6.1统计分析内容研究分析衰老患者2种不同证型的P16基因的序列突变特征和mRNA定量表达的变化。研究分析中药干预后,不同证型和P16基因的关联性中药干预后衰老患者2种不同证型P16基因mRNA表达的变化,P16基因mRNA表达变化对中药干预反应的差异。研究分析衰老患者2种证型与P16基因mRNA表达变化及P16基因型疗效关联性。研究分析中药干预后衰老2组患者的临床综合疗效。6.2统计分析方法描述性统计分析,定性指标以频数表,百分率或构成比描述定量指标以均数,标准差,或中位数,下四分位数(Q1),上四分位数(Q3),最小值,最大值描述。P16基因频率计数法,等位基因频率的比较采用X2检验。两组对比分析,定性资料采用卡方检验,Fisher精确概率法,Wilcoxon秩和检验,CMH2检验,WLS协方差。定量资料符合正态分布用t检验(组间进行方差齐性检验,以0.05作为检验水准,方差不齐时选用Satterthwaite方法进行校正的t检验),不符合正态分布用Wilcoxon秩和检验,Wilcoxon符号秩和检验GLM协方差。多组间比较方差分析,组间两两比较用q检验等级资料用秩和检验。各组治疗前后比较用配对t检验。以上统计分析均SAS统计软件进行处理。7治疗结果7.1衰老患者2种不同证型的P16基因的序列特征(图1~图2)从图1~图2中表明,肾阴虚、肾阳虚2种证型P16基因的序列特征未见明显差异。图1肾阴虚证型P16基因测序图图2肾阳虚证型P16基因测序图7.2衰老患者2种不同证型的P16基因mRNA定量表达的比较(图3~8)从图3至8中表明,参黄冲剂组治疗后衰老患者P16基因mRNA扩增曲线起始循环数(ct值)明显变大,对照组治疗后衰老患者P16基因mRNA扩增曲线起始循环数(ct值)无明显差异。参黄冲剂组治疗后肾阴虚、肾阳虚两种证型P16基因mRNA扩增曲线起始循环数(ct值)未见明显差异。图3治疗前参黄冲剂组衰老患者P16基因mRNA扩增曲线图4治疗后参黄冲剂组衰老患者P16基因mRNA扩增曲线图5治疗前对照组衰老患者P16基因mRNA扩增曲线图6治疗后对照组衰老患者P16基因mRNA扩增曲线图7治疗后参黄冲剂组肾阴虚衰老患者P16基因mRNA扩增曲线图8治疗后参黄冲剂组肾阳虚衰老患者P16基因mRNA扩增曲线7.3两组治疗前后衰老患者P16基因mRNA定量表达比较(表1)表1两组治疗前后衰老患者P16基因mRNA定量表达比较(±S)分组治疗前治疗后参黄冲剂组对照组26.20±1.37◆39.90±2.34▲26.57±1.5927.97±1.90※治疗前两组比较p0.05◆,治疗后与对照组比较p0.05治疗后二组比较具有统计学意义p0.05◆由表2可以看出,治疗后两组衰老主要证型肾阴虚、肾阳虚P16基因mRNA定量表达无统计学意义p0.05。7.5两组治疗后衰老患者临床疗效比较(表3)表3两组治疗后衰老患者临床疗效比较组别例数显效有效无效有效率(%)参黄冲剂组30321680.0▲对照组301121743.3两组间比较p0.05)。参黄冲剂组治疗后肾阴虚、肾阳虚两种证型P16基因mRNA扩增曲线起始循环数(ct值)未见明显差异(p0.05)参黄冲剂组与对照组在治疗前的衰老患者P16基因mRNA定量表达无统计学意义p0.05,二者之间具有可比性在治疗后两组比较具有统计学意义p0.05),证明参黄冲剂对不同证型衰老患者均有疗效,可显著改善中老年患者临床症状,提高日常生活能力。因为衰老的发生及治疗恢复是渐进漫长的过程,而不同年龄性别以及个人遗传,生活方式等诸多因素亦对疗效有不同影响,因此在今后的研究中要适当扩大样本量,延长实验时间同时增加动物实验,以更好地选取标本探讨衰老发生演变和治疗的机制探讨中药预防、治疗对不同证型衰老患者的疗效以及提高疗效的有效途径,包括干预时机、方式等,并从中筛选有效方剂和中药有效成分以及用分子遗传学等方法从多角度、多手段探讨衰老及中药抗衰老的机理等,都是今后可以进一步探讨的方向。参考文献1朱文锋等,中医临床诊疗术语证侯部分,中国标准出版社,1997年,1339.2郦章安等,现代老年药学,中国医药科技出版社,2001年,825828.3中药新药临床研究指导原则,北京中国医药科技出版社,2002年,378390.4何海蓉,褪黑激素的抗衰老研究进展J.国外医学,老年医学分册,2000,5.5SerranoM,HanhonGJ,BeachD.AnewregulatorymotifyincellcyclecontrolcousingspecificinhibitionofcyclinD/CDK4.Nature,1993.366704.707.

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