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活性调节细胞骨架蛋白mRNA 在大鼠岛叶电点燃模型海马中的表达.doc

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活性调节细胞骨架蛋白mRNA 在大鼠岛叶电点燃模型海马中的表达.doc

基金项目国家自然科学基金资助(30750014);宁夏自然科学基金资助NZ09118作者单位750004银川,宁夏医科大学附属医院神经外科;宁夏回族自治区颅脑疾病重点实验室通信作者孙涛,EMAILSUNTAONXMUEDUCN活性调节细胞骨架蛋白MRNA在大鼠岛叶电点燃模型海马中的表达张培松王峰刘庆祝徐文中齐江华刘铮孙涛【摘要】目的探讨电点燃和单一电刺激大鼠岛叶模型ARCMRNA在海马中的表达及意义。方法雄性SD大鼠随机分为点燃组、单一电刺激组、假手术组和正常对照组,每组按时间点分两个亚组。点燃组建立电刺激岛叶慢性癫痫模型,按时间点实验后断头取脑,应用RTPCR进行海马ARCMRNA的检测;应用原位杂交进行齿状回ARCMRNA的检测;单一电刺激组只刺激两次,余同点燃组;假手术组只是不行点燃刺激,余同点燃组;正常对照组不给予手术干预。结果单一电刺激组、假手术组和空白对照组在3H时ARCMRNA表达分别为072014,075016,071014,显著低于点燃组海马组织中ARCMRNA的表达178043(P001),6H时4组间ARCMRNA表达差异无统计学意义(P005);原位杂交细胞计数显示点燃后3HARCMRNA的表达为1128个60个,显著高于单一电刺激组、假手术组和空白对照组ARCMRNA的表达,分别为4625个435个,4525个623个,4475个649个(P001),6H时4组间ARCMRNA表达差异无统计学意义(P005)。结论岛叶癫痫发作可引起海马ARCMRNA表达增加;突触可塑性在岛叶癫痫中起着重要作用。【关键词】岛叶;活性调节细胞骨架蛋白;点燃;突触可塑性MRNAEXPRESSIONOFACTIVITYREGULATEDCYTOSKELETALASSOCIATEDPROTEININTHEHIPPOCAMPUSINDUCEDBYTHEINSULARKINDLEDRATSZHANGPEISONG,WANGFENG,LIUQINGZHU,,XUWENZHONG,,QIJIANGHUA,,LIUZHENG,,SUNTAODEPARMENTOFNEUROSURGERY,THEAFFILIATEDHOSPITALOFNINGXIAMEDICALUNIVERSITY,KEYLABOFCRANIOCERBRALDISEASE,NINGXIAHUIAUTONOMOUSREGION,YINCHUAN750004,CHINACORRESPONDINGAUTHORSUNTAO,EMAILSUNTAONXMUEDUCN【ABSTRACT】OBJECTIVETOINVESTIGATETHEEXPRESSIONOFARCMRNAININSULARELECTRICALKINDLEDANDASINGLEELECTRICALSTIMULATEDRATSANDITSSIGNIFICANCEMETHODSMALESDRATSWEREDIVIDEDINTOKINDLEDGROUPANDASINGLEELECTRICALSTIMULATEDGROUPANDSHAMOPERATEDGROUPANDCONTROLGROUPRANDOMLY,EACHGROUPISDIVIDEDINTO2SUBGROUPSATDIFFERENTTIMEPOINTKINDLEDGROUPTOESTABLISHCHRONICINSULARELECTRICALKINDLEDMODEL,ANDTHENDECAPITATETOMAKERTPCROFARCMRNAONHIPPOCAMPUS,ANDTOAPPLYINSITUHYBRIDIZATIONOFARCMRNAONDENTATEGYRUS;ASINGLEELECTRICALSTIMULATEDGROUPUSETHESAMEMETHODTOTHEKINDLEDGROUPWITHONLYTWICEELECTRICALSTIMULATIONSHAMOPERATEDGROUPUSETHESAMEMETHODTOTHEKINDLEDGROUPWITHOUTELECTRICALSTIMULATIONCONTROLGROUPWITHOUTSURGERYRESULTSEXPRESSIONOFARCMRNAINTHEHIPPOCAMPUSOFASINGLEELECTRICALSTIMULATEDGROUPANDSHAMOPERATEDGROUPANDCONTROLGROUPWERE072014,075016,071014,SIGNIFICANTLYLESSTHANKINDLEDGROUPTHATWAS178043(P001)AT3H,THEEXPRESSIONOFARCMRNAWASNOSIGNIFICANTDIFFERENCEP﹥005AMONG4GROUPSAT6H;ARCMRNAINSITUHYBRIDIZATIONCELLCOUNTSHOWEDTHEEXPRESSIONOFARCMRNAINKINDLEDGROUPWAS112860,SIGNIFICANTLYHIGHERTHANASINGLEELECTRICALSTIMULATEDGROUPANDSHAMOPERATIONGROUPANDCONTROLGROUPTHATWERE4625435,4525623,4475649(P001)AFTER3H,THEREWERENOSIGNIFICANTDIFFERENCEP﹥005AMONG4GROUPSAT6HCONCLUSIONTHERESULTSSUGGESTEDTHATTHEINSULAREPILEPSYCANINCREASETHEEXPRESSIONOFARCMRNAINHIPPOCAMPUS;ARCMAYBEPLAYANIMPORTANTROLEINTHESYNAPTICPLASTICITYOFINSULAREPILEPSY【KEYWORDS】INSULAR;ACTIVITYREGULATEDCYTOSKELETONASSOCIATEDPROTEIN;KINDLING;SYNAPTICPLASTICITY颞叶癫痫是临床上常见的难治性癫痫,手术是其首选治疗,大多数患者预后良好,但有一部分患者手术疗效差,甚至无效,目前有研究显示岛叶可能在其中起到重要作用。关于岛叶起源癫痫发生机制目前尚不清楚。目前研究认为突触可塑性在癫痫的启动及维持中起到关键作用。活性调节细胞骨架蛋白ARC是即早基因的一种效应子。其蛋白产物能移动、积聚于被激活神经元的突触,特定蓄积于突触活性位点,使其蛋白表达产物在突触可塑性中起着核心作用1。本研究采用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)、原位杂交方法分别观察海马、齿状回中的ARCMRNA在电点燃大鼠岛叶癫痫模型中的表达,探讨ARC在岛叶癫痫中可能所起到的作用及意义。材料和方法一、实验动物及分组6~8周龄雄性SPRAGUEDAWLEY大鼠(由宁夏医科大学动物实验中心提供),体重225G~250G,单笼饲养,昼夜循环12/12H。随机分为点燃组、单一电刺激组、假手术组和空白组,每组分两个亚组N7,各组大鼠体重差异无统计学意义(F0195,P﹥005)。二、模型制作1.电极植入戊巴比妥钠(50MG/KG)麻醉大鼠,将大鼠固定于脑立体定位仪(SR5R),门齿杠放置于耳间平面下方33MM,按照SD大鼠图谱(PAXINOS和WATSON,1987)确定左侧岛叶皮质位置(前囟前12MM;旁开55MM;硬膜下55MM);右额(前囟前15MM;旁开15MM;硬膜下05MM)。立体定位仪辅助下,小型牙科钻钻透颅骨,双极电极垂直颅骨表面,插入岛叶皮质内,硬膜下55MM,然后牙科水泥固定于颅骨表面。双极电极作为刺激电极及记录电极;单级电极安放于右额作为接地电极。所有电极均由三孔接插件引出。术后连续3天腹腔注射青霉素4万U/KG,以预防感染。假手术组只植入电极,不再给予任何电刺激。电极植入部位在实验结束后以组织切片确定。2.后放阈测定术后恢复2周,测定每只大鼠的后放阈。用AMSYSTEMS2100刺激器给大鼠持续电流刺激。刺激参数为脉冲双向方波,波宽10MS,频率60HZ,持续1S。刺激强度开始为100ΜA,以后每隔90S增加50ΜA,直到EEG记录到≥3S的后发放电,为该大鼠的后放阈。3.单一电刺激测定大鼠后放阈后第2天15倍后放阈刺激1次,然后饲养1周,期间不再给予任何刺激。第10天进行第2次15倍后放阈刺激1次,以最后1次刺激为准,然后在3、6H时无痛处死大鼠。4.点燃每天按后放阈15倍强度刺激2次,刺激时间为1S,刺激间隔1H,连续刺激至少6D,直至出现5次Ⅴ级发作,视为点燃成功。以最后一次刺激为准,然后在3、6H时无痛处死大鼠。发作强度按RACINE分级评分Ⅰ级不动、闭眼,面肌轻微痉挛;Ⅱ级点头;Ⅲ级单侧前肢阵挛;Ⅳ级双前肢阵挛;Ⅴ级全身阵挛发作。三、标本采集及保存各组大鼠按时间点乙醚麻醉,一部分断头取脑,迅速剥离左侧海马组织,液氮中冷冻,然后转移到15MLEP管,80℃保存。一部分用PBS及多聚甲醛经左心室灌注固定后取脑,4%多聚甲醛后固定,蔗糖脱水,液氮中OCT包埋后保存于80℃冰箱中。美国LEICA恒低温切片机行左侧半脑冠状冰冻切片,片厚14ΜM,行ARCMRNA原位杂交实验。四、RNA提取及RTPCR检测ARCMRNA在左侧海马中的表达1.按TRIZOL法提取RNA。TRIZOL由INVITROGEN提供。2.RTPCR引物设计参考文献2设计的ARC引物序列上游引物5ACAGAGGATGAGACTGAGGCAC3,下游引物5TATTCAGGCTGGGTCCTGTCAC3,扩增77BPDNA片段;内参Β肌动蛋白上游引物5CCCATCTATGAGGGTTACGC3,下游引物5TTTAATGTCACGCACGATTTC3,扩增150BPDNA片段,以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。RTPCR试剂盒购于PROMEGA公司,反应体系为25LAMV/TFL5反应缓冲液5L,DNTP混合物(每DNTP10MMOL/L)05L,上下游引物10MOL/L各15L,25MMOL/LMGSO41L,AMV反转录酶(5U/L)05L,TFLDNA聚合酶(5U/L)05L,RNA样品1G,加无核酸酶水至25L。反应条件为48℃,45MIN反转录,94℃,2MINAMV反转录酶灭活RNA/CDNA/引物变性;95℃15S变性,58℃40S退火,72℃30S延伸共40个循环;72℃,7MIN总延伸。PCR产物鉴定取25ΜLPCR产物,4琼脂糖凝胶,100V电泳40MIN后观察。电泳完毕后,将电泳凝胶置于SYNGENE凝胶图像分析系统上分析,以ARC与Β肌动蛋白的吸光度比值表示最终结果。五、ARCMRNA原位杂交原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供,具体实验过程按试剂盒说明书操作。ARCMRNA胞质染成棕黄色颗粒(图5A箭头),在高倍(400倍)显微镜下随机选取齿状回3个视野进行单位面积细胞计数,以3个视野的平均数表示最终结果。六、统计学分析应用SPSS120统计软件。实验数据均用SX表示,成组设计多组均数的比较用单因素方差分析,组间比较用LSDT检验;同组不同时间点比较采用重复测量的方差分析,以P﹤005为差异有统计学意义。结果1.癫痫发作电刺激大鼠岛叶后放阈为648士139ΜA。点燃速度为86土21D。点燃大鼠最初表现为动须、闭眼、面肌痉挛、节律性咀嚼,接着前肢抬起、抽搐随即跌倒,最后以湿狗样抖动结束,发作时间持续约30S至几分钟。2.脑电图点燃组大鼠背景脑电图与正常脑电图差异无统计学意义(F1197,P﹥005);点燃大鼠脑电图显示慢波节律增多,间断出现尖波、棘波(图1B),并与湿狗样抖动动作同步。AB图1ALPHALAB脑电同步记录系统记录大鼠脑电图A正常脑电图BⅤ级发作时脑电图LFP局部场电位(V)3.脑电频率场电位点燃大鼠Ⅴ级发作时导致大脑神经元异常和过度超同步化放电,使其脑电频率明显增加。与正常脑电频率相比点燃大鼠Ⅴ级发作时脑电频率增加差异有统计学意义(F1963611,P﹤001)。AB图2ALPHALAB脑电同步记录系统记录大鼠脑电频率场电位A正常脑电频率,主要集中在5~6HZ内B点燃大鼠Ⅴ级发作时的脑电频率,主要集中在28~30HZ4.海马ARCMRNA的表达RTPCR结果图3,4显示3H4组间ARCMRNA表达差异有统计学意义(F31064,P﹤001),其中点燃组与单一电刺激组、假手术组、空白组相比ARCMRNA表达在3H均显著增高(P﹤001);6H四组间ARCMRNA表达差异无统计学意义(F0400,P﹥005);点燃组ARCMRNA表达在3和6H差异有统计学意义(F30783,P﹤001),3H表达明显增高。M标准参照物;1ARCMRNA;2Β肌动蛋白MRNAA空白组;B点燃组3H;C点燃组6H;D单一电刺激组3H;E单一电刺激组6H;F假手术组3H;G假手术组6H图3各组大鼠不同时间点间ARCMRNA扩增后的电泳图点燃组与其他4组及不同时间点比较ARCMRNA在3H均AP001图4各组大鼠不同时间点海马结构区ARCMRNA的表达5.齿状回ARCMRNA的表达原位杂交结果图5,6显示3H4组间ARCMRNA表达差异有统计学意义(F204692,P﹤001),其中点燃组与单一电刺激组、假手术组、空白组相比ARCMRNA表达在3H均显著增高(P﹤001);6H4组间ARCMRNA表达差异无统计学意义(F0021,P﹥005);点燃组ARCMRNA表达在3和6H差异有统计学意义(F171484,P﹤001),3H表达明显增多。图5大鼠海马间齿状回ARCMRNA原位杂交400A3H点燃组;B3H单一电刺激组;C3H假手术组;D6H点燃组;E6H单一电刺激组;F6H假手术组各组3及6H均可见ARCMRNA的表达,且点燃组3H表达增多(A箭头),其余表达较少

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