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结核分支杆菌特异性抗原重组蛋白MPT63 检测系统的建立.doc

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结核分支杆菌特异性抗原重组蛋白MPT63 检测系统的建立.doc

结核分支杆菌特异性抗原重组蛋白MPT63检测系统的建立程国平李克生张润玲【摘要】目的建立规范的结核分枝杆菌mycobacteriumtuberculosis,MTB特异性抗原重组蛋白MPT63酶联免疫吸附试验enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA检测系统。方法采用方阵法确定蛋白包被浓度和酶标二抗浓度,以ROC(ReceiverOperatingCharacteristic)曲线法确定MPT63蛋白ELISA法检测的cutoff值。探讨规范的ELISA检测系统建立的方法。结果ELISA检测系统MPT63蛋白包被浓度1﹕128000,酶浓度1﹕1000时为最佳在cutoff值为0.350.4时检测MPT63蛋白抗体的灵敏度和特异性最为理想,分别是75和78.6。结论用方阵法确定蛋白包被浓度和酶标二抗浓度,并以ROC曲线法确立cutoff值是建立规范化的ELISA检测系统的关键环节。关键词重组蛋白MPT63ELISAROC曲线cutoff值EstablishmentdetectionsystemofrecombinationproteinMPT63onmycobacteriumtuberculosisspecificantigenCHENGGuoping,DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofScienceandTechnology,Henan471000,ChinaLIKeshengMedicalScienceResearchInstituteofGansuprovinceBiotechnologyCenter,ZhangRunlingTheoriginalDepartmentofClinicalLaboratory,TheSecondAffiliatedHospitalofLanzhouUniversityLaboratory【Abstract】ObjectiveTosetupastandardtestingsystemofmycobacteriumtuberculosisspecificantigenrecombinatedMPT63proteinbyenzymelinkedimmunosorbentassaymethod.MethodsThesquarematrixmethodisusedtodeterminetheconcentrationofcoatedproteinandtheconcentrationofenzymelabelingantibody.ReceiverOperatingCharacteristicmethodisusedtodeterminethecutoffvalueofELISAdetectedMPT63protein.ToapproachaestablishmentofstandardELISAdetectionsystem.ResultsELISAdetectedMPT63proteinmayattainhighersensibilityandspecificitywhenthecoatedproteinisdilutedaccordingto1﹕128000andtheenzymelabelingantibodyisdilutedby1﹕1000.ConclusionsThecriticalelementsinELISAdetectionsystemaretheapplicationofsquarematrixmethodtodeterminetheconcentrationofcoatedproteinandtheconcentrationofenzymelabelingantibodyandapplicationtheROCtodeterminecutoff.KeywordsRecombinationproteinMPT63ELISAROCCutoff结核病(TB)已成为我国乃至世界危害最严重的疾病之一1,2000年第四次1作者单位471000河南科技大学第一附属医院检验科(程国平)甘肃省医学科学研究院生物技术中心(李克生)原兰州大学第二附属医院检验科(张润玲)全国结核病流行病学抽样调查发现,我国感染人数5.5亿,活动性肺结核人数600万,死亡人数25万。但是目前对结核病早期快速准确的诊断是临床工作的难点,制约结核病的治疗和感染的控制。寻找一种快速、准确和实用的结核病感染的诊断方法乃是当务之急。随着致病性结核杆菌全基因组的测序工作完成2,应用双向电泳、质谱及生物信息学技术开展的结核杆菌蛋白质组学研究,多种结核分支杆菌特异性蛋白抗原不断被发现3,为结核病血清学检测奠定了基础。血清学检测中,ELISA以其灵敏,简单,快速和廉价等特点在临床检验方面被广泛应用。本文以结核分枝杆菌特异性蛋白MPT63为抗原,探讨建立规范的检测其抗体的ELISA检测系统。1材料与方法1.1标本来源本实验阳性和阴性对照血清由甘肃省医学科学院提供另外,收集2008年1月至2010年5月甘肃省肺科医院按照结核病诊断标准4确诊为肺结核的患者血清,男性50例,年龄1572岁女性48例,年龄1668岁健康对照为健康体检者98例男性53例,年龄2068岁女性45例,年龄1865岁。采集空腹静脉血液3mL,立即分离血清储存于70℃备用。1.2试剂MTB特异性抗原重组MPT63蛋白由中国药品生物制品鉴定所惠赠辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG购自北京中山生物公司蛋白Marker为普利莱公司产品。1.3仪器酶标仪(芬兰产Thermolabsystems的MultiskanMK3)洗板机(芬兰产Thermolabsystems的MultiskanMK3)蛋白测量仪琼脂糖凝胶电泳仪(法国西比亚)。2方法2.1MPT63蛋白的测定。蛋白测量仪测得MTB特异性抗原重组蛋白MPT63在260nm和280nm波长的OD值,依据公式蛋白含量OD2801.45OD2600.74mg/ml计算出蛋白含量。琼脂糖凝胶电泳观察MPT63蛋白的纯度并检测其分子量。2.2用方阵的方法选择ELISA检测系统的抗原包被浓度和酶标浓度。包被液(PH9.6)稀释MPT63蛋白分别为1﹕200040008000160003200064000128000256000八个浓度梯度,包被聚苯乙烯微孔板,置于4℃冰箱过夜用含2.5胎牛血清白蛋白和2.5酪蛋白封闭液封闭微孔板,37℃孵育2h,干燥过夜,装铝箔袋,封口备用用样本稀释液按1﹕20比例稀释混合阳性血清和混合阴性血清,加入包被好的微孔板,37℃孵育0.5h洗板机洗6次,将羊抗人IgG标记的辣根过氧化物酶稀释成1﹕5007501000150020003000六个浓度梯度即如微孔板,37℃孵育0.5h洗板机洗6次。加入邻苯二胺酶的底物溶液孵育,2MOL/lH2SO4终止反应。酶标仪波长450nm处测OD值。以灵敏度为纵坐标假阳性率1特异性为横坐标绘制各个抗原包被浓度和各个酶浓度下的ROC曲线,比较获得最佳的抗原包被浓度和酶浓度。2.3以ROC曲线确定ELISA检测系统的cutoff值。以上述选择的最佳抗原包被浓度包被微孔板和最佳的酶标浓度检测98份阳性血清标本和98份血清阴性标本的吸光度(OD),以ROC曲线描述此检验方法的灵敏度与假阳性率之间的关系。曲线下面积最大时的灵敏度与特异性的点对应的OD值就是该抗原检测的cutoff值,待测标本OD≥该cutoff值为阳性,待测标本OD该cutoff值为阴性。3结果3.1重组MPT63蛋白浓度为4.172mg/ml,分子量16000。3.2不同包被抗原浓度与酶浓度下,检测的OD值见表1。比较不同包被抗原浓度的ROC曲线得出MPT63蛋白在包被浓度1﹕128000时可使测定得到好的灵敏度和特异性5,见图1。比较不同酶浓度的ROC曲线得出酶浓度1﹕1000时可使测定得到好的灵敏度和特异性5,见图2。表1不同包被抗原浓度与酶浓度的检测OD值酶浓度包被抗原浓度1﹕20001﹕40001﹕80001﹕160001﹕320001﹕640001﹕1280001﹕25600015000.110.150.330.160.230.250.180.120.270.190.390.280.560.390.70.711﹕7500.370.240.190.130.180.290.150.180.210.140.330.180.420.240.470.341﹕10000.540.340.70.290.730.350.540.280.570.330.520.360.580.150.640.231﹕15000.30.190.270.140.310.150.320.150.460.300.340.170.740.300.660.571﹕20000.270.190.220.130.190.10.450.10.130.130.290.200.320.300.720.551﹕30000.120.130.130.420.130.040.150.020.250.140.140.080.250.20.350.39注为重组MPT63蛋白ELISA检测系统的最佳抗原包被浓度和酶浓度所对应cutoff值。图1抗原包被浓度1﹕128000反应曲线图二酶浓度1﹕1000反应曲线3.3根据假设的不同cutoff值区间,计算各区间的灵敏度和特异性,见表2,所对应的ROC曲线见图3。由图3可看出ELISA检测MPT63蛋白,在灵敏度75和特异性78.6时的点曲线下面积最大,此点所对应的cutoff值为0.350.4。表2不同cutoff值检测的灵敏度和特异性OD界值特异性灵敏度OD界值特异性灵敏度00.0501000.70.7510019.120.050.117.861000.750.810014.760.10.1532.1497.060.80.8510014.710.150.25094.120.850.910013.240.20.2564.2989.710.90.9510011.770.250.371.4382.350.95110010.290.30.357577.9411.051007.350.350.478.57751.051.11007.350.40.4582.1463.241.11.151004.410.450.589.2951.471.151.21002.940.50.5592.8642.651.21.251002.940.550.692.8632.351.251.31001.470.60.6596.4330.881.31.351001.470.650.710020.591.351.41001.47图3抗原包被浓度1﹕128000与酶浓度1﹕1000时反应曲线cutoff值为灵敏度75、特异性78.6的点所对应的OD值即0.350.44讨论4.1在ELISA抗原固相化过程中,蛋白抗原通过疏水性相互作用吸附于聚苯乙烯等固相表面,这种非共价被动吸附过程中,由于蛋白吸附于固相的随意性,吸附于固相表面的蛋白结构可能由于折叠、功能行结合部位朝向固相等而发生严重的改变。此外,在固相的不同位点它们与固相的结合程度也有差异,结合疏松的容易发生脱吸附(测定中68被动吸附的抗原或抗体可能会发生脱吸附)。脱吸附的抗原或抗体会成为免疫反应中的竞争物,从而导致免疫测定的精密度降低5。以最适浓度固相化抗原或抗体是减少这种影响的简单、有效措施,而以最适浓度固相化抗原,正是本试验的核心环节之一。4.2在抗原或抗体的被动吸附包被过程中,不管加入的抗原或抗体的量多大,聚苯乙烯塑料表面吸附的最大限度为1.5ng/mm2,占整个固相表面的1/3,处于次限度的抗原或抗体蛋白分子均匀分布。一旦包被用抗原或抗体蛋白过量,由于蛋白蛋白的相互作用叠集而致固相上多层蛋白的形成,则会出现大于固相最大结合限度的吸附,这种因蛋白间的相互作用而形成的次级吸附很不稳定,从而干扰免疫测定5。因此本试验采用八个包被抗原浓度梯度,比较发现,当抗原包被浓度在1﹕128000时,其实际包被抗原的含量为3.2μg/ml,较其他七个包被浓度灵敏度和特异性相对高。这与文献5报道的用于包被抗原或抗体的理想浓度通常在1~10μg/ml之间也相吻合。以六个酶浓度梯度调试,得出了相对最为合适的MPT63蛋白ELISA检测的酶浓度。此MPT63蛋白ELISA检测系统科学的的保证了抗原以适当的浓度包被于固相载体参与反应的酶适量。因此,最大限度避免了常见的包被抗原蛋白叠集和所用酶不适量的情况。4.3目前国内以ELISA为研究方法的大多采用测定标本对阴性比值法testtonegativeratio,TNR假定在每批测定中包含大量的阴性控制样本,于是每份测定标本均可以与阴性控制样本值的中值的比值来表示,设标本的测定值为Y,阴性对照值的中值为M,一般将Y/M≥2或3定为阳性,cutoff值计算公式为2或3(阴性对照值的中值),这种设定方法对避免假阳性结果的出现较好,但假阴性可能比例较高,该方法是一种粗糙的cutoff值设定方法5。4.4结核分枝杆菌特异性抗原MPT63蛋白是结核分枝杆菌的重要抗原之一,以ROC曲线法建立MPT63蛋白系统,为结核分枝杆菌其他抗原建立规范的ELISA检测提供了理论依据和尝试。目前研究已经发现了多种结核分枝杆菌特异性抗原蛋白,联合多种抗原进行检测,在保证特异性的基础上有助于提高诊断的敏感性。如果均能采取这种规范的方法,建立起各个特异性抗原的ELISA检测系统,结核病的血清学诊断水平有望提高一步。参考文献1陈晓旭结核分枝杆菌的分子生物学检测方法研究现状J中国煤炭工业医学杂志2003,26174175.2ColeST,BroschR,ParkhillJ,etal.DecipheringthebiologyofM.tuberculosisfromthecompletegenomeseguence.Nature,1998,3966707190198.3AlitoA,MeNairJ,GirvinRM.IdentificationofMycobacteriumbovisantigensbyanalysisofbovinTcellresponsesafterinfectionwithavirulentstrain,BrazJMedBiolRes.2003361115231531.4王琳刘坦业肺结核诊断标准与治疗管理规范J海峡预防医学杂2001,7616185李金明临床酶免疫测定技术M.人民军医出版社2005,32728。6GallD,NielsenK.ComparisonofsomemethodsfordeterminingcutoffvaluesforserologicalassaysAretrospectivestudyusingthefluoresscsncepolarizationassaysJimmunochem,2001222285.

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