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结核分支杆菌特异性抗原重组蛋白MPT63 检测系统的建立.doc

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结核分支杆菌特异性抗原重组蛋白MPT63 检测系统的建立.doc

结核分支杆菌特异性抗原重组蛋白MPT63检测系统的建立程国平李克生张润玲【摘要】目的建立规范的结核分枝杆菌MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS,MTB特异性抗原重组蛋白MPT63酶联免疫吸附试验ENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAY,ELISA检测系统。方法采用方阵法确定蛋白包被浓度和酶标二抗浓度,以ROC(RECEIVEROPERATINGCHARACTERISTIC)曲线法确定MPT63蛋白ELISA法检测的CUTOFF值。探讨规范的ELISA检测系统建立的方法。结果ELISA检测系统MPT63蛋白包被浓度1﹕128000,酶浓度1﹕1000时为最佳;在CUTOFF值为03504时检测MPT63蛋白抗体的灵敏度和特异性最为理想,分别是75和786。结论用方阵法确定蛋白包被浓度和酶标二抗浓度,并以ROC曲线法确立CUTOFF值是建立规范化的ELISA检测系统的关键环节。关键词重组蛋白MPT63;ELISA;ROC曲线;CUTOFF值ESTABLISHMENTDETECTIONSYSTEMOFRECOMBINATIONPROTEINMPT63ONMYCOBACTERIUMTUBERCULOSISSPECIFICANTIGENCHENGGUOPING,DEPARTMENTOFCLINICALLABORATORY,THEFIRSTAFFILIATEDHOSPITALOFHENANUNIVERSITYOFSCIENCEANDTECHNOLOGY,HENAN471000,CHINALIKESHENGMEDICALSCIENCERESEARCHINSTITUTEOFGANSUPROVINCEBIOTECHNOLOGYCENTER,ZHANGRUNLINGTHEORIGINALDEPARTMENTOFCLINICALLABORATORY,THESECONDAFFILIATEDHOSPITALOFLANZHOUUNIVERSITYLABORATORY【ABSTRACT】OBJECTIVETOSETUPASTANDARDTESTINGSYSTEMOFMYCOBACTERIUMTUBERCULOSISSPECIFICANTIGENRECOMBINATEDMPT63PROTEINBYENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYMETHODMETHODSTHESQUAREMATRIXMETHODISUSEDTODETERMINETHECONCENTRATIONOFCOATEDPROTEINANDTHECONCENTRATIONOFENZYMELABELINGANTIBODYRECEIVEROPERATINGCHARACTERISTICMETHODISUSEDTODETERMINETHECUTOFFVALUEOFELISADETECTEDMPT63PROTEINTOAPPROACHAESTABLISHMENTOFSTANDARDELISADETECTIONSYSTEMRESULTSELISADETECTEDMPT63PROTEINMAYATTAINHIGHERSENSIBILITYANDSPECIFICITYWHENTHECOATEDPROTEINISDILUTEDACCORDINGTO1﹕128000ANDTHEENZYMELABELINGANTIBODYISDILUTEDBY1﹕1000CONCLUSIONSTHECRITICALELEMENTSINELISADETECTIONSYSTEMARETHEAPPLICATIONOFSQUAREMATRIXMETHODTODETERMINETHECONCENTRATIONOFCOATEDPROTEINANDTHECONCENTRATIONOFENZYMELABELINGANTIBODYANDAPPLICATIONTHEROCTODETERMINECUTOFFKEYWORDSRECOMBINATIONPROTEINMPT63;ELISA;ROC;CUTOFF;结核病(TB)已成为我国乃至世界危害最严重的疾病之一1,2000年第四次1作者单位471000河南科技大学第一附属医院检验科(程国平);甘肃省医学科学研究院生物技术中心(李克生);原兰州大学第二附属医院检验科(张润玲)全国结核病流行病学抽样调查发现,我国感染人数55亿,活动性肺结核人数600万,死亡人数25万。但是目前对结核病早期快速准确的诊断是临床工作的难点,制约结核病的治疗和感染的控制。寻找一种快速、准确和实用的结核病感染的诊断方法乃是当务之急。随着致病性结核杆菌全基因组的测序工作完成2,应用双向电泳、质谱及生物信息学技术开展的结核杆菌蛋白质组学研究,多种结核分支杆菌特异性蛋白抗原不断被发现3,为结核病血清学检测奠定了基础。血清学检测中,ELISA以其灵敏,简单,快速和廉价等特点在临床检验方面被广泛应用。本文以结核分枝杆菌特异性蛋白MPT63为抗原,探讨建立规范的检测其抗体的ELISA检测系统。1材料与方法11标本来源本实验阳性和阴性对照血清由甘肃省医学科学院提供;另外,收集2008年1月至2010年5月甘肃省肺科医院按照结核病诊断标准4确诊为肺结核的患者血清,男性50例,年龄1572岁;女性48例,年龄1668岁;健康对照为健康体检者98例男性53例,年龄2068岁;女性45例,年龄1865岁。采集空腹静脉血液3ML,立即分离血清储存于70℃备用。12试剂MTB特异性抗原重组MPT63蛋白由中国药品生物制品鉴定所惠赠;辣根过氧化物酶标记的羊抗人IGG购自北京中山生物公司;蛋白MARKER为普利莱公司产品。13仪器酶标仪(芬兰产THERMOLABSYSTEMS的MULTISKANMK3);洗板机(芬兰产THERMOLABSYSTEMS的MULTISKANMK3);蛋白测量仪;琼脂糖凝胶电泳仪(法国西比亚)。2方法21MPT63蛋白的测定。蛋白测量仪测得MTB特异性抗原重组蛋白MPT63在260NM和280NM波长的OD值,依据公式蛋白含量OD280145OD260074MG/ML计算出蛋白含量。琼脂糖凝胶电泳观察MPT63蛋白的纯度并检测其分子量。22用方阵的方法选择ELISA检测系统的抗原包被浓度和酶标浓度。包被液(PH96)稀释MPT63蛋白分别为1﹕2000;4000;8000;16000;32000;64000;128000;256000八个浓度梯度,包被聚苯乙烯微孔板,置于4℃冰箱过夜;用含25胎牛血清白蛋白和25酪蛋白封闭液封闭微孔板,37℃孵育2H,干燥过夜,装铝箔袋,封口备用;用样本稀释液按1﹕20比例稀释混合阳性血清和混合阴性血清,加入包被好的微孔板,37℃孵育05H;洗板机洗6次,将羊抗人IGG标记的辣根过氧化物酶稀释成1﹕500;750;1000;1500;2000;3000六个浓度梯度即如微孔板,37℃孵育05H;洗板机洗6次。加入邻苯二胺酶的底物溶液孵育,2MOL/LH2SO4终止反应。酶标仪波长450NM处测OD值。以灵敏度为纵坐标;假阳性率1特异性为横坐标绘制各个抗原包被浓度和各个酶浓度下的ROC曲线,比较获得最佳的抗原包被浓度和酶浓度。23以ROC曲线确定ELISA检测系统的CUTOFF值。以上述选择的最佳抗原包被浓度包被微孔板和最佳的酶标浓度检测98份阳性血清标本和98份血清阴性标本的吸光度(OD),以ROC曲线描述此检验方法的灵敏度与假阳性率之间的关系。曲线下面积最大时的灵敏度与特异性的点对应的OD值就是该抗原检测的CUTOFF值,待测标本OD≥该CUTOFF值为阳性,待测标本OD该CUTOFF值为阴性。3结果31重组MPT63蛋白浓度为4172MG/ML,分子量16000。32不同包被抗原浓度与酶浓度下,检测的OD值见表1。比较不同包被抗原浓度的ROC曲线得出MPT63蛋白在包被浓度1﹕128000时可使测定得到好的灵敏度和特异性5,见图1。比较不同酶浓度的ROC曲线得出酶浓度1﹕1000时可使测定得到好的灵敏度和特异性5,见图2。表1不同包被抗原浓度与酶浓度的检测OD值酶浓度包被抗原浓度1﹕20001﹕40001﹕80001﹕160001﹕320001﹕640001﹕1280001﹕2560001500011015033016023025018012027019039028056039070711﹕7500370240190130180290150180210140330180420240470341﹕1000054034070290730350540280570330520360580150640231﹕1500030190270140310150320150460300340170740300660571﹕200002701902201301901045010130130290200320300720551﹕300001201301304201300401500202501401400802502035039注为重组MPT63蛋白ELISA检测系统的最佳抗原包被浓度和酶浓度所对应CUTOFF值。图1抗原包被浓度1﹕128000反应曲线图二酶浓度1﹕1000反应曲线33根据假设的不同CUTOFF值区间,计算各区间的灵敏度和特异性,见表2,所对应的ROC曲线见图3。由图3可看出ELISA检测MPT63蛋白,在灵敏度75和特异性786时的点曲线下面积最大,此点所对应的CUTOFF值为03504。表2不同CUTOFF值检测的灵敏度和特异性OD界值特异性灵敏度OD界值特异性灵敏度000501000707510019120050117861000750810014760101532149706080851001471015025094120850910013240202564298971090951001177025037143823509511001029030357577941105100735035047857751051110073504045821463241111510044104505892951471151210029405055928642651212510029405506928632351251310014706065964330881313510014706507100205913514100147图3抗原包被浓度1﹕128000与酶浓度1﹕1000时反应曲线CUTOFF值为灵敏度75、特异性786的点所对应的OD值即035044讨论41在ELISA抗原固相化过程中,蛋白抗原通过疏水性相互作用吸附于聚苯乙烯等固相表面,这种非共价被动吸附过程中,由于蛋白吸附于固相的随意性,吸附于固相表面的蛋白结构可能由于折叠、功能行结合部位朝向固相等而发生严重的改变。此外,在固相的不同位点它们与固相的结合程度也有差异,结合疏松的容易发生脱吸附(测定中68被动吸附的抗原或抗体可能会发生脱吸附)。脱吸附的抗原或抗体会成为免疫反应中的竞争物,从而导致免疫测定的精密度降低5。以最适浓度固相化抗原或抗体是减少这种影响的简单、有效措施,而以最适浓度固相化抗原,正是本试验的核心环节之一。42在抗原或抗体的被动吸附包被过程中,不管加入的抗原或抗体的量多大,聚苯乙烯塑料表面吸附的最大限度为15NG/MM2,占整个固相表面的1/3,处于次限度的抗原或抗体蛋白分子均匀分布。一旦包被用抗原或抗体蛋白过量,由于蛋白蛋白的相互作用叠集而致固相上多层蛋白的形成,则会出现大于固相最大结合限度的吸附,这种因蛋白间的相互作用而形成的次级吸附很不稳定,从而干扰免疫测定5。因此本试验采用八个包被抗原浓度梯度,比较发现,当抗原包被浓度在1﹕128000时,其实际包被抗原的含量为32ΜG/ML,较其他七个包被浓度灵敏度和特异性相对高。这与文献5报道的用于包被抗原或抗体的理想浓度通常在1~10ΜG/ML之间也相吻合。以六个酶浓度梯度调试,得出了相对最为合适的MPT63蛋白ELISA检测的酶浓度。此MPT63蛋白ELISA检测系统科学的的保证了抗原以适当的浓度包被于固相载体;参与反应的酶适量。因此,最大限度避免了常见的包被抗原蛋白叠集和所用酶不适量的情况。43目前国内以ELISA为研究方法的大多采用测定标本对阴性比值法TESTTONEGATIVERATIO,TNR假定在每批测定中包含大量的阴性控制样本,于是每份测定标本均可以与阴性控制样本值的中值的比值来表示,设标本的测定值为Y,阴性对照值的中值为M,一般将Y/M≥2或3定为阳性,CUTOFF值计算公式为2或3(阴性对照值的中值),这种设定方法对避免假阳性结果的出现较好,但假阴性可能比例较高,该方法是一种粗糙的CUTOFF值设定方法5。44结核分枝杆菌特异性抗原MPT63蛋白是结核分枝杆菌的重要抗原之一,以ROC曲线法建立MPT63蛋白系统,为结核分枝杆菌其他抗原建立规范的ELISA检测提供了理论依据和尝试。目前研究已经发现了多种结核分枝杆菌特异性抗原蛋白,联合多种抗原进行检测,在保证特异性的基础上有助于提高诊断的敏感性。如果均能采取这种规范的方法,建立起各个特异性抗原的ELISA检测系统,结核病的血清学诊断水平有望提高一步。参考文献1陈晓旭结核分枝杆菌的分子生物学检测方法研究现状J中国煤炭工业医学杂志2003,261741752COLEST,BROSCHR,PARKHILLJ,ETALDECIPHERINGTHEBIOLOGYOFMTUBERCULOSISFROMTHECOMPLETEGENOMESEGUENCENATURE,1998,39667071901983ALITOA,MENAIRJ,GIRVINRMIDENTIFICATIONOFMYCOBACTERIUMBOVISANTIGENSBYANALYSISOFBOVINTCELLRESPONSESAFTERINFECTIONWITHAVIRULENTSTRAIN,BRAZJMEDBIOLRES2003;3611152315314王琳刘坦业肺结核诊断标准与治疗管理规范J海峡预防医学杂2001,7616185李金明临床酶免疫测定技术M人民军医出版社2005,3;2728。6GALLD,NIELSENKCOMPARISONOFSOMEMETHODSFORDETERMININGCUTOFFVALUESFORSEROLOGICALASSAYSARETROSPECTIVESTUDYUSINGTHEFLUORESSCSNCEPOLARIZATIONASSAYSJIMMUNOCHEM,2001;222285

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