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全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26 标记.doc

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全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26 标记.doc

DEPARTMENTOFOBSTETRICSANDGYNECOLOGY,ZHUJIANGHOSPITAL,SOUTHERNMEDICALUNIVERSITY,GUANGZHOU510282,GUANGDONGPROVINCE,CHINAYEXIAOFENG★,STUDYINGFORMASTER’SDEGREE,DEPARTMENTOFOBSTETRICSANDGYNECOLOGY,ZHUJIANGHOSPITAL,SOUTHERNMEDICALUNIVERSITY,GUANGZHOU510282,GUANGDONGPROVINCE,CHINA320367163COMCORRESPONDENCETOHEYUANLI,CHIEFPHYSICIAN,PROFESSOR,DEPARTMENTOFOBSTETRICSANDGYNECOLOGY,ZHUJIANGHOSPITAL,SOUTHERNMEDICALUNIVERSITY,GUANGZHOU510282,GUANGDONGPROVINCE,CHINASUPPORTEDBYTHENATIONALNATURALSCIENCEFOUNDATIONOFCHINA,NO81041101;THENATURALSCIENCEFOUNDATIONOFGUANGDONGPROVINCE,NO10451051501004704RECEIVED20101203ACCEPTED20110117全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记★叶小凤,何援利,王雪峰,付霞霏BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSISOLATEDFROMRATSBYWHOLEBONEMARROWADHERENTCULTUREINVITROANDPKH26LABELINGYEXIAOFENG,HEYUANLI,WANGXUEFENG,FUXIAFEIABSTRACTBACKGROUNDINVITROCULTURING,AMPLIFICATIONANDLABELINGAREIMPORTANTLINKSTOHARVESTLABELEDRATBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSBMSCSTHATARESATISFACTORYTOANIMALEXPERIMENTOBJECTIVETOEXPLOREACONVENIENTANDPRACTICALMETHODFORSEPARATINGANDLABELINGBMSCSUSINGWHOLEBONEMARROWADHERENTCULTURE,ANDLABELINGWITHPKH26INVITROMETHODSBMSCSWEREISOLATEDANDCULTIVATEDFROMTHEBONEMARROWOFRATSBYWHOLEBONEMARROWADHERENTCULTUREFURTHERPURIFICATIONWASACHIEVEDBYEXPANSIONATSERIALPASSAGESTHEPASSAGE3BMSCSWERECULTUREDANDLABELEDWITHPKH26THEGROWTH,FLUORESCENCEINTENSITYANDSERIALSUBCUHIVATIONOFLABELEDBMSCSWEREANALYZEDWITHFLUORESCENCEMICROSCOPETHEPROLIFERATIONABILITYOFTHESELABELEDCELLSWASTESTEDBYMTTRESULTSANDCONCLUSIONBMSCSWEREISOLATEDANDPURIFIEDSUCCESSFULLYANDEFFECTIVELYBYTHEMETHODOFWHOLEBONEMARROWADHERENTCULTURETHELABELEDBMSCSAPPEAREDREDFLUORESCENCEAFTER3PASSAGESOFSERIALSUBCULTIVATION,THEFLUORESCENCEINTENSITYANDTHELABELINGRATEOFBMSCSWEREGRADUALLYDECREASEDTHEBIOLOGICALFEATURESSUCHASMORPHOLOGY,GROWTHINVITROWERENOTAFFECTEDBYLABELINGBMSCSCANBESUCCESSFULLYCULTIVATEDBYWHOLEBONEMARROWADHERENCEMETHODCONVENIENTLYLABELINGTHEBMSCSWITHPKH26ISANEFFECTIVEANDPRACTICALMETHODYEXF,HEYL,WANGXF,FUXFBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSISOLATEDFROMRATSBYWHOLEBONEMARROWADHERENTCULTUREINVITROANDPKH26LABELINGZHONGGUOZUZHIGONGCHENGYANJIUYULINCHUANGKANGFU2011;151017111714HTTP//WWWCRTERCNHTTP//ENZGLCKFCOM摘要背景要获得动物实验需要的标记大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增和示踪已成为实验的关键环节。目的采用全骨髓培养分离大鼠骨髓间充质干细胞,以及PKH26对其体外标记,建立一种方便、实用的分离培养并示踪骨髓间充质干细胞的方法。方法通过全骨髓培养分离法纯化大鼠骨髓间充质干细胞。经传代扩增,细胞进一步纯化。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞按PKH26标记程序进行标记后培养,荧光显微镜下观察标记后细胞生长状态、萤光强度变化和传代培养效果。利用四唑盐比色法测定标记后骨髓间充质干细胞的生长曲线。结果与结论全骨髓培养分离法能成功获得纯度高的骨髓间充质干细胞,用PKH26标记后的骨髓间充质干细胞呈红色荧光,体外连续传代培养3代后,细胞荧光强度逐渐减弱。PKH26标记骨髓间充质干细胞的生长形态、生长活力不发生改变。结果证实全骨髓培养分离法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好的骨髓间充质干细胞,PKH26荧光标记大鼠骨髓间充质干细胞是一种有效、实用的方法。关键词全骨髓培养;骨髓间充质干细胞;分离;培养;PKH26DOI103969/JISSN16738225201110001叶小凤,何援利,王雪峰,付霞霏全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记J中国组织工程研究与临床康复,2011,151017111714HTTP//WWWCRTERORGHTTP//CNZGLCKFCOM0引言骨髓间充质干细胞BONEMARROWDERIVEDMESENCHYMALSTEMCELLS,BMSCS是来源于骨髓支持结构的一小群成体干细胞,因其具有自我更新、多向分化潜能和较强的增殖能力,在适当条件下可分化为肝细胞样细胞、骨细胞、脂肪细胞等,是细胞治疗和基因工程的重要种子细胞。BMSCS具有获取简便、对供体损伤小、增殖能力强、免疫原性弱、自体移植不发生排斥反应等特点,已成为研究的热点。在本实验中,通过全骨髓贴壁法分离纯化BMSCS,并用荧光染料PKH26进行标记,为利用BMSCS进行体内移植研究提供实验基础。1材料和方法设计单一样本观察。时间及地点实验于201002/06在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。材料动物实验动物为WISTAR大鼠2只,雌雄不限,68周龄,体质量100150G,购自南方医科大学动物实验中心。叶小凤,等全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记POBOX1200,SHENYANG110004CNZGLCKFCOM1712WWWCRTERORG南方医科大学珠江医院妇产科,广东省广州市510282叶小凤★,女,1984年生,广东省佛山市人,汉族,南方医科大学在读硕士,主要从事生殖内分泌的研究。320367163COM通讯作者何援利,主任医师,教授,南方医科大学珠江医院妇产科,广东省广州市510282中图分类号R3942文献标识码A文章编号167382252011100171104收稿日期20101203修回日期2011011720101203001/WZ主要试剂实验方法BMSCS的分离纯化及培养13将大鼠以水合氯醛过量麻醉处死后用体积分数为75乙醇浸泡5MIN,于超净台上无菌条件下分离出大鼠股骨和胫骨,将骨骺端剪去,暴露两端骨髓腔,用5ML注射器抽取含体积分数为10胎牛血清的培养液反复冲洗骨髓腔,冲洗液收集到无菌离心管中,得到的细胞悬液以1000R/MIN离心5MIN。弃去上清液,加入培养液充分吹打至单细胞悬液,接种于塑料培养瓶中,置37℃、体积分数5CO2、饱和湿度培养箱中培养。两三天视情况首次换液,以后每3D换液1次,710D细胞生长融合达80以上时,以25G/L胰蛋白酶消化后按1∶3比例传代培养。倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况。BMSCS的鉴定取第3代大鼠BMSCS,制成单细胞悬液,流式细胞仪检测CD29、CD44、CD90、CD45的表达。PKH26标记BMSCS用无血清培养液洗涤胰酶消化后得到的BMSCS细胞悬液大约21010L1,把细胞吸入至EP管,再次洗涤,取细胞沉淀,加入稀释液C重悬细胞。染色前,准备PKH26染液用稀释液C稀释置于离心管中。迅速地将细胞液加入到PKH26染料应用液中,立即用吸管均匀快速混合样品,因为均匀的染色是在瞬间发生的。25℃孵育5MIN,定时轻轻颠倒离心管保证在25℃充分混匀。加入血清终止反应,放置1MIN,用完全培养液稀释,离心,移去上清,将细胞移入新的离心管中,进一步以PBS洗3次。离心后重悬成需要的浓度,接种于培养瓶中。以锡纸包被培养瓶后于37℃培养箱中避光培养。第2天在荧光显微镜下观察染色的效果和荧光强度,并观察细胞活力。MTT法检测细胞增殖能力参照文献4取对数生长期的未标记及已标记细胞消化后,计数、稀释,接种于96孔板,每孔体积为100ΜL,两种细胞各接种35各个复孔,每天同时各取两种细胞的5个复孔,每孔加入MTT5G/L20ΜL,4H后吸去培养液,加DMSO100ΜL每孔,轻轻振荡10MIN使结晶充分溶解,酶标仪上490NM测定吸光度值A值,连续7D,并绘制生长曲线。主要观察指标①BMSCS生长特性。②BMSCS的鉴定。③PKH26标记细胞结果。④标记大鼠BMSCS生长曲线。2结果21BMSCS生长特性将骨髓接种于培养瓶后,可见大量悬浮细胞。24H后仍可见以红细胞为主的大量细胞悬浮,这时已可见部分细胞贴壁,胞体为纺锤形或三角形,仍有良好折光性。48H后进行首次换液,可除去大量未贴壁细胞,换液后见贴壁细胞呈散在分布,呈细长梭形,细胞折光性较差。第3天后可观察到细胞形成多个集落样分布的克隆集团,折光性差。第4天左右可观察到细胞数量明显增多,细胞形态丰富,突起形似树枝状增长增粗,细胞排列呈网状。细胞贴壁面积达8090时,细胞排列紧密,呈旋涡状或鱼群状,可见少量圆形细胞或胞体大且折光明显的细胞贴附其中。细胞培养5D左右可第1次传代。每四五天即可传代1次,随传代次数增加,细胞生长速度加快,且每一次传代可得到纯度更高的BMSCS。传至第3代已可得到纯度较高的BMSCS。见图1。22BMSCS的鉴定经流式细胞术检测,第3代BMSCS的CD29、CD44、CD90均呈高表达,分别为9787、9884、9943,而CD45阳性表达则极低,仅为046。见图2。23PKH26标记细胞结果BMSCS标记后染料在细胞膜上分布均匀、一致,在荧光倒置显微镜下细胞呈红色荧光,标记率可达100。标记后的BMSCS轮廓仍然清晰可辨,见图3。试剂来源PKH26试剂盒PKH26染料1瓶01ML,1103MOL/L乙醇液中稀释液C1瓶10MLDMEM/F12胎牛血清PBS缓冲液MTT试剂SIGMA公司HYCLONE公司杭州四季青公司武汉博士德公司广州威佳科技有限公司FIGURE1THIRDPASSAGEOFBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLS100图1第3代大鼠骨髓间充质干细胞100叶小凤,等全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记ISSN16738225CN211539/RCODENZLKHAH1713WWWCRTERORG细胞标记后7D红色荧光未见明显减弱。传代扩增至第3次后红色荧光在细胞膜上逐渐减弱,呈颗粒状的光点分布。随着传代次数的增多,PKH26标记的细胞荧光强度逐渐减弱。经过12次传代后,荧光倒置显微镜下已看不到红色荧光。24标记大鼠BMSCS生长曲线PKH26标记BMSCS与未标记细胞未见明显差异,见图4。3讨论BMSCS广泛分布于人体各种器官和组织,但最富集和研究最多的是骨髓的BMSCS5。由于骨髓中间充质干细胞数量少,平均每10万个有核细胞中仅含有1各BMSCS6,并且体外培养条件下,仅有少数BMSCS能活跃复制。因此,探索体外分离、纯化和大量扩增BMSCS的方法,保持其增殖潜能与多向分化潜能的适宜培养条件,是进一步开展间充质干细胞应用研究的重要实验基础。目前,从骨髓中分离和纯化BMSCS的方法主要有712①全骨髓细胞接种法。②密度梯度离心法。③细胞表面分子标记分选法。④免疫磁珠法。本实验选用全骨髓细胞培养法分离BMSCS。此法是利用BMSCS对培养瓶的黏附性而造血细胞为悬浮生长的原理将目的细胞在每次换液时与其他造血细胞分离,虽混有巨噬细胞等引起纯度不足,但可在传代时严格控制胰酶的量和消化时间,利用BMSCS易脱落的特点,保证其在短时间与培养瓶底分开,巨噬细胞等则在仍贴附于瓶底,从而使BMSCS纯度提高。全骨髓培养法避免了反复离心造成的细胞损伤、丢失,亦避免了PERCOLL分离液对细胞活性的影响。增加传代次数将有助于进一步提高BMSCS的纯度,而有限的多次传代不会改变BMSCS的生物学特性。BMSCS的鉴定目前尚缺乏严格、统一的标准13,根据细胞治疗国际社会推荐的标准INTERNATIONALSOCIETYFORCELLULARTHERAPY,ISCT,人BMSCS的鉴定标准如下①细胞可贴壁生长,呈成纤维细胞样形态。②有特异的表面分子表达。③具有向骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的多潜能14。大鼠BMSCS鉴定常采取生物学特性观察及特异的表面分子检测①BMSCS贴壁生长,并呈纤维细胞样生长,细胞密度较高时会呈旋涡状、鱼群状排列,这是与骨髓中其他细胞相鉴别的主要特征。②通过流式细胞异检测细胞表面标记进行鉴定。普遍认为BMSCS必须表达CD105、CD44、CD90等,但缺乏典型造血细胞抗原,也就是CD45等1517。近年发现,BMSCS具有多向分化潜能,且体外基因转染率高,因而已成为组织工程、细胞移植治疗、基因治疗等方面的研究热点1821。为追踪观察移植体内细胞的存活、滞留、分布情况,必须将移植细胞加以标记,以便识别和监测2224。PKH26是一种亲脂性的荧光染料,可与细胞膜不可逆地结合,在荧光显微镜下发出红色荧光。随着细胞分裂,标记的荧光染料均匀地分配到两个子细胞中。将标记后的BMSCS移植于活体靶器官后,可以利用荧光显微镜观察标记细胞的存活和迁移情况。已有报道将PKH26用于构建组织工程血管、皮肤、FIGURE4GROWTHCURVEOFLABELEDANDNONLABELEDBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLS图4PKH26标记组与未标记组细胞生长曲线的比较201510050A490NM1234567TIMEDPKH26LABELEDGROUPMONLABELEDGROUPFIGURE2FLOWCYTOMETRYANALYSISOFTHE3RDPASSAGEOFBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSSURFACEMARKERS图2第3代BMSCS表面标记物流式细胞仪检测结果FIGURE3BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSBMSCSLABELEDWITHPKH26图3PKH26标记后骨髓间充质干细胞ABMSCSLABELEDBUTWITHOUTADHERENCE100BAT3DAFTERLABELING200C3RDPASSAGEOFLABELEDBMSCS200D6THPASSAGEOFLABELEDBMSCS200叶小凤,等全骨髓法体外培养分离大鼠骨髓间充质干细胞及PKH26标记POBOX1200,SHENYANG110004CNZGLCKFCOM1714WWWCRTERORG神经等的种子细胞的标记2527。PKH26可用于长期标记,但不改变细胞膜重要功能表面蛋白区,在适当的标记浓度下基本不影响BMSCS的生长状态、增殖,PKH26标记强度稳定,具有良好的可重复性2829。应用PKH26标记细胞,然后与未标记细胞共培养,发现PKH26不能从活细胞甚至死亡或凋亡的细胞释放出来,因而能够清楚地区分移植细胞和宿主细胞,可见PKH26是BMSCS体内示踪的良好染料。标记后的BMSCS荧光均匀地分布于整个细胞膜上。细胞分裂时,结合染料的细胞膜易随之均等地分配到两个子细胞,因而荧光强度会随着传代次数的增多而逐渐减弱30。经过12次传代约50D后,荧光显微镜下已看不到红色荧光。综上所述,本实验建立了一种方便、实用的分离培养并示踪BMSCS的方法。此法能获取数量可观,活力好的BMSCS,并能追踪移植体内的BMSCS的定位情况,在基础及临床研究上有广阔的前景。4参考文献1DENGXL,LAUCP,LAIK,ETALCELLCYCLEDEPENDENTEXPRESSIONOFPOTASSIUMCHANNELSANDCELLPROLIFERATIONINRATMESENCHYMALSTEMCELLSFROMBONEMARROWCELLPROLIF2007;4056566702LIUY,ZHANGX,DAIY,ETALEFFECTSOFBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSONLEARNINGANDMEMORYFUNCTIONALRECOVERYINNEONATALRATSWITHHYPOXICISCHEMICBRAINDAMAGEZHONGHUAERKEZAZHI2008;4696486533YANGQ,YANGJ,XIEP,ETALEFFECTSOFCIWUJIAININDUCINGMARROWSTROMALCELLDIFFERENTIATIONINTONEURONLIKECELLSINVITRONANFANGYIKEDAXUEXUEBAO2009;2934874904HUANGQ,WANGYD,WUT,ETALPRELIMINARYSEPARATIONOFTHEGROWTHFACTORSINPLATELETRICHPLASMAEFFECTSONTHEPROLIFERATIONOFHUMANMARROWDERIVEDMESENCHYMALSTEMCELLSCHINMEDJENGL2009;122183875DOCHEVAD,POPOVC,MUTSCHLERW,ETALHUMANMESENCHYMALSTEMCELLSINCONTACTWITHTHEIRENVIRONMENTSURFACECHARACTERISTICSANDTHEINTEGRINSYSTEMJCELLMOLMED2007;11121386PITTENGERMF,MACKAYAM,BECKSC,ETALMULTILINEAGEPOTENTIALOFADULTHUMANMESENCHYMALSTEMCELLSSCIENCE1999;28454111431477PARKSH,SIMWY,PARKSW,ETALANELECTROMAGNETICCOMPRESSIVEFORCEBYCELLEXCITERSTIMULATESCHONDROGENICDIFFERENTIATIONOFBONEMARROWDERIVEDMESENCHYMALSTEMCELLSTISSUEENG2006;1211310731178DEMATTOSCARVALHOA,ALVESAL,GOLIMMA,ETALISOLATIONANDIMMUNOPHENOTYPICCHARACTERIZATIONOFMESENCHYMALSTEMCELLSDERIVEDFROMEQUINESPECIESADIPOSETISSUEVETIMMUNOLIMMUNOPATHOL2009;132243033069KODEJA,MUKHERJEES,JOGLEKARMV,ETALMESENCHYMALSTEMCELLSIMMUNOBIOLOGYANDROLEINIMMUNOMODULATIONANDTISSUEREGENERATIONCYTOTHERAPY2009;11437739110LEIZ,YONGDAL,JUNM,ETALCULTUREANDNEURALDIFFERENTIATIONOFRATBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSINVITROCELLBIOLINT2007;31991692311BEYERNARDIN,DASILVAMEIRELLESLBEYERMESENCHYMALSTEMCELLSISOLATION,INVITROEXPANSIONANDCHARACTERIZATIONHANDBEXPPHARMACOL2006;17424928212MORIKAWAS,MABUCHIY,KUBOTAY,ETALPROSPECTIVEIDENTIFICATION,ISOLATION,ANDSYSTEMICTRANSPLANTATIONOFMULTIPOTENTMESENCHYMALSTEMCELLSINMURINEBONEMARROWJEXPMED2009;206112483249613JACKSONWM,NESTILJ,TUANRSPOTENTIALTHERAPEUTICAPPLICATIONSOFMUSCLEDERIVEDMESENCHYMALSTEMANDPROGENITORCELLSEXPERTOPINBIOLTHER2010;10450551714ZHUF,GUOGH,ZHANJH,ETALZHONGGUOZUZHIGONGCHENGYANJIUYULINCHUANGKANGFU2010;14274970497朱峰,郭光华,詹剑华,等免骨髓间充质干细胞体外BRDU标记最佳时间和标记浓度的筛选中国组织工程研究与临床康复,2010,1427497049715LEEJW,GUPTAN,SERIKOVV,ETALPOTENTIALAPPLICATIONOFMESENCHYMALSTEMCELLSINACUTELUNGINJURYEXPERTOPINBIOLTHER2009;9101259127016XINGCZ,HONGJ,GUSF,ETALZHONGGUOYIKEDAXUEXUEBAO2008;37145邢承忠,洪晶,顾绍峰,等兔骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定J中国医科大学学报,2008,3714517FUX,HEY,XIEC,LIUWETALBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLTRANSPLANTATIONIMPROVESOVARIANFUNCTIONANDSTRUCTUREINRATSWITHCHEMOTHERAPYINDUCEDOVARIANDAMAGECYTOTHERAPY2008;10435336318ROSSIGNOLJ,BOYERC,LVQUEX,ETALMESENCHYMALSTEMCELLTRANSPLANTATIONANDDMEMADMINISTRATIONINA3NPRATMODELOFHUNTINGTONSDISEASEMORPHOLOGICALANDBEHAVIORALOUTCOMESBEHAVBRAINRES2011;217236937819DELCROIXGJ,GARBAYOE,SINDJIL,ETALTHETHERAPEUTICPOTENT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