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沙眼衣原体pORF8 质粒蛋白的表达及其单克隆抗体的制备与鉴定.doc

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沙眼衣原体pORF8 质粒蛋白的表达及其单克隆抗体的制备与鉴定.doc

沙眼衣原体pORF8质粒蛋白的表达及其单克隆抗体的制备与鉴定粟盛梅1,李忠玉1,黄秋林2,钟光明3,周洲1,陆春雪1(1.南华大学病原生物学研究所,衡阳4210012.南华大学第一附属医院,衡阳4210013.德州大学圣安东尼奥健康科学研究中心,德州78229)【摘要】目的表达沙眼衣原体pORF8质粒蛋白,制备其单克隆抗体(mAb),并鉴定其生物学特征。方法克隆表达pORF8融合蛋白并免疫小鼠制备致敏的脾淋巴细胞,脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞株免疫荧光实验(IFA)筛选稳定分泌抗pORF8蛋白mAbs的阳性细胞株并鉴定mAbs抗体类型ELISA法测定mAbs效价IFA、westernblot鉴定mAbs特异性。结果筛选出3株稳定分泌特异性抗pORF8mAb的杂交瘤细胞株,分别为5C2、12C7、12F8抗体类型分别为IgM、IgG3、IgG3杂交瘤细胞培养上清的抗体效价分别是12048、1512、1102412C7、12F8mAbs能同时特异性识别GSTpORF8、RFPpORF8融合蛋白,但5C2仅识别GSTpORF8融合蛋白,而不识别RFPpORF8融合蛋白。结论成功获得了3株分泌pORF8mAbs的细胞株,为研究pORF8质粒蛋白结构和功能及建立特异敏感的沙眼衣原体检测方法奠定了基础。【关键词】沙眼衣原体pORF8质粒蛋白单克隆抗体【基金项目】国家自然科学基金(30970165、81102230)湖南省高校科技创新团队资助项目(湘教通2010212号)【通讯作者】李忠玉,Emaillzhy1023hotmail.com【作者简介】粟盛梅(1971),女,副教授,主要从事衣原体致病机制研究。ExpressionofpORF8plasmidproteinofChlamydiatrachomatisandPreparation,identificationofmonoclonalantibodiesagainstpORF8SuShengmei1,LiZhongyu1,HuangQiulin2,ZhongGuangming3,ZHOUZhou1,LUChunxue11.PathogenicBiologyInstitute,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China2.FirstAffliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang421001,China.3.DepartmentofMicrobiologyandImmunology,UniversityofTexasHealthScienceCenteratSanAntonio,TX78229,USA【Abstract】ObjectiveToexpresspORF8plasmidproteinofChlamydiatrachomatisandidentifythemonoclonalantibodiesagainstpORF8plasmidprotein.MethodspORF8fusionproteinwasexpressedinE.coliXL1Blueandpurifiedwithglutathioneconjugatedagarosebeads,thenthepurifiedproteinwasusedtoimmunizeBALB/cmice,thespleencellsisolatedfromtheimmunizedmicewerefusedwithSP2/0myelomacellstogeneratemonoclonalantibodiesagainstpORF8protein.ImmunofluorescenceassayIFAwasperformedtoscreenthepositivehybridomacellsandidentifytheantibodyisotypes.ThetiterofthemAbswasdeterminedbyenzymelinkedimmunosorbentassayELISA.AndthespecificitywascharacterizedbyIFAandWesternblot.ResultsThehybridomacelllines,named5C2,12C7and12F8,stablysecretingspecificmAbsagainstpORF8wereobtained,thetiterofthreemAbsfromcellculturewere1512,12048and11024respectively.ThemAbsecretedby5C2wasclassifiedtoIgM,thoseof12C7and12F8wereclassifiedtoIgG3.12C7and12F8mAbsreactedstronglywithGSTpORF8andRFPpORF8fusion,but5C2mAbonlyrecognizedwithGSTpORF8notRFPpORF8fusionprotein.ConclusionThreeofhighspecificitymAbsagainstpORF8proteinhavebeensuccessfullypreparedwhichlayasolidfoundationforfurtherstudyonpORF8proteinfunctionanddevelopinganewdiagnosismethodtoChlamydiainfection.【Keywords】ChlamydiatrachomatispORF8plasmidproteinmonoclonalantibody沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis,Ct)是一类严格细胞内寄生的原核细胞型微生物,为发展中国家感染性致盲的首位病因,也是发达国家性传播性疾病最常见的病原体。Ct泌尿生殖道感染不仅可引起男性尿道炎、前列腺炎,女性子宫颈炎、输卵管炎等,而且会导致异位妊娠、不孕症等严重并发症12,甚至会增加HIV和宫颈癌的发病率35。Ct感染患者常表现为无症状或轻微症状,临床上不易被发现而使病人得不到及时治疗,导致感染反复迁延,造成进行性、不可逆的病理损伤。因此提高实验室诊断技术水平,尤其是早期快速诊断技术的应用,对控制Ct疾病的传播和预防并发症均具有重要的意义。本研究以重组pORF8融合蛋白为免疫原,应用杂交瘤技术建立了3株稳定分泌抗pORF8蛋白特异性单克隆抗体(mAbs)的细胞株,并对得到的这些mAbs的生物学特性进行鉴定。抗pORF8蛋白mAbs的成功研制,为进一步研究pORF8的结构与功能、建立特异敏感的Ct检测方法奠定了基础。材料和方法1材料1.1动物、菌株与细胞株CtD标准株、SP2/0骨髓瘤细胞株为美国德州大学圣安东尼奥医学研究中心(UTHSCSA)钟光明教授实验室提供BALB/c小鼠由UTHSCSA动物部提供和饲养。1.2主要试剂PEG4000购自美国Merck公司HAT、HT选择性培养基购自美国Invitrogen公司Cy3标记的羊抗鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3亚类抗血清、Cy2标记的羊抗兔抗体以及HRP标记的羊抗鼠二抗等均购自美国JacksonImmunoResearch公司。pGEX6p原核表达载体、GlutathioneSepharose4BBeads为美国GEHealthcare公司产品完全弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂购自美国Sigma公司。2方法2.1pORF8质粒蛋白抗原的制备采用PCR方法从Ct血清型D核酸中扩增pORF8基因,插入pGEX6p原核表达载体中构建pGEX6p/pORF8,重组体转化大肠杆菌XL1Blue,30℃IPTG诱导3h后,低速离心收集菌体,超声破菌后高速离心,上清经GlutathioneSepharose4BBeads纯化得到pORF8融合蛋白,纯化的融合蛋白经12SDSPAGE电泳分析,鉴定pORF8融合蛋白表达情况和纯化效果。2.2动物免疫与脾淋巴细胞制备取100gpORF8融合蛋白250L与等体积的完全弗氏佐剂超声乳化后,行小鼠腹腔注射,初次免疫后的第3周,250L(50g)融合蛋白与等体积的不完全弗氏佐剂超声乳化间隔2周以相同的免疫方式进行第2、3次免疫。第3次免疫后7~10d小鼠尾静脉采血间接免疫荧光法(IFA)测定抗体效价达到12000以上时,50gpORF8融合蛋白不加佐剂直接进行腹腔注射,3d后处死小鼠无菌分离小鼠脾脏,D0培养基洗涤3次,用针头刺破脾脏以释放淋巴细胞,淋巴细胞经100目、200目不锈钢网筛过滤收集后用于细胞融合。2.3杂交瘤细胞株的筛选脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以101比例混合后1000rpm离心10min,弃去上清后缓慢加入1mL预温的50PEG4000溶液,再加入含20胎牛血清的HAT选择培养基,将细胞悬液加入96孔细胞培养板中,37℃培养23w后观察是否有克隆形成,将克隆细胞扩大培养。以CtD标准株感染HeLa细胞后作为抗原,杂交瘤细胞株培养上清为一抗,Cy3荧光标记的抗鼠抗体为二抗,IFA筛选分泌pORF8抗体的阳性杂交瘤细胞株。2.4mAbs特异性鉴定Westernblot法进行鉴定mAbs特异性纯化的pORF8融合蛋白10μL加入等体积2SDS上样液,100℃加热5min后,12000rpm离心后取10μL行12SDSPAGE凝胶电泳,以100v恒电压转至NC膜上,5脱脂牛奶封闭后,加入杂交瘤细胞培养上清,4℃过夜,0.05PBST洗涤3次,加入HRP标记的抗鼠抗体室温放置1h,洗涤后加底物ECL显色,X片曝光显影观察结果。IFA鉴定抗pORF8蛋白mAbs特异性具体方法参照文献6,7。将本室已构建好的pDSRed/pORF8真核表达重组体转染HeLa细胞,pORF8基因在Hela细胞中表达RFPpORF8融合蛋白,以杂交瘤培养上清为一抗,Cy2标记的羊抗鼠抗体为二抗进行免疫荧光染色,分析抗体的特异性。2.5mAbs效价测定采用间接ELISA法测定mAbs效价。纯化的pORF8融合蛋白以10g/mL包被酶标板,4℃过夜,5BSA室温封闭1h,加入倍比稀释的不同浓度的杂交瘤细胞培养上清,37℃孵育1h后,0.05PBST洗涤3次,再加入12000稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体孵育,洗涤后加入显色剂ABTS,室温避光反应15min,加终止液终止反应,酶标仪读取405nm波长的A值,以产生阳性反应的样品最高稀释倍数为其效价。2.6mAbs亚类鉴定应用IFA法鉴定单mAbs亚类。Ct血清型D标准株感染Hela细胞40h后,2多聚甲醛室温固定30min,2Saponine室温1h,用含10小牛血清的DMEM封闭1h,以杂交瘤细胞培养上清为一抗,Cy3标记的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM为二抗,同时以Hoechst染色DNA,进行免疫荧光染色,荧光显微镜下观察结果。结果1pORF8融合蛋白表达与纯化阳性重组菌经IPTG诱导表达pORF8融合蛋白,GlutathioneSepharose4Bbeads亲和层析纯化融合蛋白,纯化产物经12SDSPAGE电泳分析,发现重组质粒菌在约54kDa位置处有一明显蛋白条带,结果与预期GSTpORF8融合蛋白分子量相符(GST分子量为26kDa,pORF8分子量约为28kDa)(图1)。1蛋白标准分子量2纯化的pORF8融合蛋白图1pORF8融合蛋白的表达与纯化1Proteinmarker2PurifiedproductfromE.colitransformedwithpGEX6p/pORF8Fig.1ExpressionandidentificationofpORF8fusionprotein2杂交瘤细胞株的建立pORF8融合蛋白免疫鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,IFA筛选阳性克隆,阳性杂交瘤细胞以有限稀释法进行45次亚单克隆后,共获得了3株抗体分泌稳定的杂交瘤细胞株,分别命名为5C2、12C7、12F8。将杂交瘤细胞株稳定传代后冻存于液氮罐中,复苏后仍能有效地分泌mAbs。3mAbs的效价与特异性鉴定采用间接ELISA测定5C2、12C7、12F8mAbs效价,3株杂交瘤细胞株培养上清的mAbs效价分别是12048、1512、11024。Westernblot鉴定抗体的特异性结果显示3株mAbs在pORF8融合蛋白处均出现了一条分子量约为54kDa清晰的条带图2。IFA结果显示12C7、12F8能识别HeLa细胞胞浆表达的RFPpORF8融合蛋白,而5C2不识别RFPpORF8蛋白(图3)。图2Westernblot分析pORF8质粒蛋白mAbs特异性Fig.2IdentificationofthespecificityofmAbsagainstpORF8plasmidproteinbyWesternblot红色RFP融合蛋白绿色单克隆抗体染色蓝色DNA染色图3IFA鉴定抗pORF8质粒蛋白特异性Fig.3IdentificationofthespecificityofmAbsagainstpORF8plasmidproteinbyIFARedRFPfusionproteinGreenmAbstainingBlueDNAstaining4mAbs亚类鉴定以感染Ct血清型D的Hela细胞为抗原,IFA鉴定mAbs亚类,结果如图4,5C2、12F8mAbs与Cy3标记的羊抗鼠IgG3抗体结合,12C7mAb与Cy3标记的羊抗鼠IgM抗体结合,使Ct包涵体呈红色,而5C2、12F8mAbs未与Cy3标记的羊抗鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b抗体结合,12C7mAb未与Cy3标记的羊抗鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b抗体结合,故Ct包涵体呈蓝色(DNA),因此,5C2、12F8抗体类型为IgG3,12C7抗体类型为IgM。红色单克隆抗体染色蓝色DNA染色图4抗pORF8质粒蛋白mAbs亚类鉴定Fig.4SubclassanalysisofmAbsagainstpORF8plasmidproteinRedmAbstainingBlueDNAstaining讨论Ct是人类重要的致病菌,引起广泛的致病谱。因而迫切需要建立灵敏特异的检测方法。目前Ct的实验诊断方法主要有细胞培养法、血清学诊断以及核酸检测,这些诊断方法各有其优缺点,但都难以对Ct患者作出早期快速诊断,因此,寻找有效的、敏感的、特异性的诊断试剂、诊断方法仍然是目前亟待解决的问题。pORF8是由Ct质粒编码的一种质粒蛋白,基因全长744bp,编码247个氨基酸,生物信息学分析质粒基因组特征发现ORF7、ORF8具有与SopA/B、ParA/B操纵子某些相似的特征8,9,其编码产物与重复序列结合或分离可控制衣原体质粒拷贝数,而质粒拷贝数与生长期密切相关,在衣原体发育周期前期阶段,质粒与染色体基因组的比率明显增加,16h达到最高峰,而当EB开始分化为RB时,质粒与染色体基因组的比率逐渐减少10。提示pORF8可能参与衣原体发育过程。有研究报道Ct质粒不是其生长、复制必需的元件11,但与衣原体毒力密切相关1214。pORF8质粒蛋白是否参与了Ct致病过程以及致病机制如何由于缺乏基因转移系统,pORF8质粒蛋白功能目前仍不清楚。制备mAb通常采用生物化学方法分离纯化天然蛋白或其它抗原作为免疫原,然而pORF8质粒蛋白在Ct上表达有限,并且纯化难度大,很难获得足量的天然的质粒蛋白抗原。本实验采用基因工程方法在大肠杆菌中表达质粒融合蛋白,用谷胱苷肽Sepharose4B纯化pORF8融合蛋白,并按常规剂量和方法免疫小鼠,在细胞融合之前进行IFA检测特异性抗体滴度以确定免疫效果,在抗体滴度达到12000以上时进行融合反应。应用免疫荧光试验筛选阳性克隆,经过4~5次亚克隆后,实验仍出现阳性结果即确认为阳性克隆,最终我们成功地获得了3株抗体分泌稳定的杂交瘤细胞株,在进行WesternBlot分析pORF8质粒蛋白mAbs特异性时,3株mAbs均识别GSTpORF8融合蛋白,但是在IFA进一步鉴定mAbs的特异性时,我们发现12C7、12F8mAbs识别RFPpORF8融合蛋白,而5C2mAb不识别相应的RFP融合蛋白,分析其可能存在以下2个原因其一可能是由于GST具有一定的免疫原性,因此在用重组蛋白免疫动物时,主要产生了抗GST抗体所致其二可能是所产生的mAbs不识别RFP融合蛋白构象表位。本研究以重组pORF8融合蛋白为免疫原,应用杂交路技术建立了3株稳定分泌抗pORF8蛋白特异性mAbs的细胞株,并对得到的这些mAbs的生物学特性进行鉴定。抗pORF8蛋白mAbs的成功研制,对进一步探讨pORF8的生物学功能、阐明衣原体的致病机制、开发新的免疫诊断试剂奠定了基础。参考文献1KinnunenAH,SurcelHM,LehtinenM,etal.HLADQallelesandinterleukin10polymorphismassociatedwithChlamydiatrachomatisrelatedtubalfactorinfertilityacasecontrolstudyJ.HumReprod,2002,178207378.2BrunhamRC,ReyLadinoJ.ImmunologyofChlamydiainfectionimplicationsforaChlamydiatrachomatisvaccineJ.NatRevImmunol,2005,5214961.3CristinaFerreiraSilvaL,EspinosaMirandaA,SantosBatalhaR,etal.ChlamydiatrachomatisinfectionamongHIVinfectedwomenattendinganAIDSclinicinthecityofManaus,BrazilJ.BrazJInfectDis,2012,16433538.4VerteramoR,PierangeliA,ManciniE,etal.HumanPapillomavirusesandgenitalcoinfectionsingynaecologicaloutpatientsJ.BMCInfectDis,2009,911627.5OhJK,FranceschiS,KimBK,etal.PrevalenceofhumanpapillomavirusandChlamydiatrachomatisinfectionamongwomenattendingcervicalcancerscreeningintheRepublicofKoreaJ.EurJCancerPrev,2009,1815661.6LiZ,ChenC,ChenD,etal.CharacterizationoffiftyputativeinclusionmembraneproteinsencodedintheChlamydiatrachomatisgenomeJ.InfectImmun,2008,766274657.

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