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3 种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用.pdf

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3 种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用.pdf

第36卷第4期湖南农业大学学报自然科学版VOL36NO42010年8月JOURNALOFHUNANAGRICULTURALUNIVERSITYNATURALSCIENCESAUG.2010DOI103724/SPJ12382010004593种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用曾强1,黄良宗1,李丹1,朱燕秋2,谢海燕2,顾万军关键词板蓝根;甘草;鱼腥草;猪繁殖与呼吸综合征病毒11佛山科学技术学院生命科学学院,广东佛山528231;2东莞市动物疫病预防控制中心,广东东莞523107摘要为研究板蓝根、甘草和鱼腥草3种中药粗提物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒PORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUS,PRRSV的作用,采用体外细胞培养法,在MARC145单层细胞上,对3种中药粗提物进行直接抗PRRSV活性试验.结果表明,板蓝根和甘草粗提物阻断PRRSV的最佳质量浓度分别为3125、0391MG/ML,抑制PRRSV感染的最佳质量浓度分别为3125、0782MG/ML,直接灭活PRRSV的最佳质量浓度分别为1563、0782MG/ML;鱼腥草粗提物质量浓度为0782MG/ML时,阻断和抑制PRRSV感染的效果最好,但对PRRSV没有直接灭活作用.3种中药粗提物均有不同程度的体外抗PRRSV活性作用,其中板蓝根的效果最好.中图分类号S8537文献标志码A文章编号10071032201004045905ANTIVIRUSACTIVITYOFTHREECHINESEHERBSAGAINSTPORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUSINVITROZENGQIANG1,HUANGLIANGZONG1,LIDAN1,ZHUYANQIU2,XIEHAIYAN2,GUWANJUN11COLLEGEOFLIFESCIENCE,FOSHANUNIVERSITY,FOSHAN,GUANGDONG528231,CHINA;2CENTERFORANIMALDISEASECONTROLANDPREVENTIONOFDONGGUAN,DONGGUAN,GUANGDONG523107,CHINAABSTRACTANTIVIRALACTIVITYOFISATISTINCTORIA,GLYCYRRHIZAANDHOUTTUYNIACORDATAEXTRACTIONAGAINSTPORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUSWASESTIMATEDINTHEMONOLAYERMARC145CELLTHERESULTSHOWEDTHATASFORPRECAUTION,INHIBITIONANDTHEDIRECTKILLINGFUNCTION,THEBESTCONCENTRATIONOFISATISTINCTORIWERE3125,3125AND1563MG/ML;THEOPTIMUMCONCENTRATIONOFGLYCYRRHIZAWERE0391,0782AND0782MG/ML,RESPECTIVELYTHEOPTIMUMCONCENTRATIONOFHOUTTUYNIACORDATAFORPRECAUTIONANDINHIBITIONWAS0782MG/ML,WHILEWITHONTHEDIRECTKILLINGFUNCTIONITINDICATEDTHATALLOFTHESETHREECHINESETRADITIONALMEDICINESHADDIFFERENTDEGREESOFANTIVIRALACTIVITYAGAINSTPRRSVANDTHEISATISTINCTORIABEHAVEDTHEBESTINTHESECHINESETRADITIONALMEDICINESINVITROKEYWORDSISATISTINCTORIA;GLYCYRRHIZ;HOUTTUYNIACORDATA;PORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUS猪繁殖与呼吸综合征病毒PORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUS,PRRSV感染主要损伤巨噬细胞,降低机体免疫力,引起继发感染,防治难度大.使用抗生素和抗病毒药易产生污染和毒副作用.目前主要靠接种疫苗来对该病进行预防,尚无有效的治疗药物1.弱毒疫苗免疫效果较好,但本身存在散毒危险23.灭活疫苗接种后,特异性抗体产生的滴度低,速度慢,只能提供部分免疫保护46.毋安雄等6发现国内主要厂家生产的猪PRRSV灭活苗免疫效果不理想,所以,提高疫苗免疫的保护抗体水平和细胞免疫是抗PRRSV感染的关键7.较多中药具有免疫调节作用和抗病毒作用,作为保健防病药物和添加剂,可改善和提高机体的免疫功能8,提高机体的抗病力和抵抗力1.抗病毒感染的单味中药具有抑制病毒增殖或灭活,阻止病毒吸附细胞的作用9.中国中药资源丰富,在治收稿日期2010033基金项目广东省科技计划项目2008A020100020;广东省自然科学基金34064;东莞市高等院校科研机构科技项目2007108101114作者简介曾强1970,男,广东翁源县人,硕士,兽医师,主要从事预防兽医研究;通讯作者,GUWANJUN163COM460湖南农业大学学报自然科学版2010年8月疗病毒感染性疾病方面具有独特的优势101材料与方法.采用体外细胞培养的方法,在MARC145单层细胞上,对板蓝根、甘草和鱼腥草粗提物进行抗PRRSVPX株试验,旨在探明3种中药体外抗PRRSVPX株的作用效果.11材料板蓝根、甘草、鱼腥草均购自广州清平中药专业市场.PRRSVPX株、MARC145细胞由广东省农业科学院兽医研究所人畜共患病室保存.PRRSVPX株临用前于37℃解冻,用MARC145细胞维持液稀释成100TCID50细胞生长液含低糖DMEMGIBCO产品,加入10新生小牛血清GIBCO产品,每100ML营养液加入1ML10000IU青霉素和链霉素.细胞维持液含5新生小牛血清、MTT、34,6二甲基噻唑2X12,5乙苯基四唑溴盐购自AMRESCO公司、二甲基亚砜DMSO,分析纯,购自天津福晨化学试剂有限公司.备用.酶联免疫检测仪1681000XC为BIORAD公司产品.12方法1213种中药粗提物的提取用常规水煎煮法粗提3种中药粗提物取板蓝根、甘草和鱼腥草各100G,煎煮3次第1次加8倍水浸泡,用武火加热,沸腾后用文火加热LH,6层纱布过滤得初滤液;第2次将第1次过滤后的药渣加5倍水煎煮50MIN,过滤;第3次将第2次过滤后的药渣加5倍水煎煮50MIN,过滤,合并3次滤液,水浴浓缩至含生药LG/ML,3000R/MIN离心20MIN,得上清液,用孔径022ΜM滤器过滤,除菌后分装,4℃冷藏备用.122PRRSVPX株的50组织培养感染剂量测定将MARC145细胞进行消化传代,每1ML细胞数调整至1106个,加入到96孔细胞培养板中01ML/孔,于5CO2培养箱中37℃培养11.待细胞长成单层后,接种稀释度10-8~10-1的病毒液01ML/孔,每个稀释度接种8孔,于5CO2培养箱中37℃培养120H,每天观察细胞病变CPE情况12.根据REEDMUENCH公式,计算50组织培养感染剂量TCID5013.TCID501233种中药粗提物安全浓度的测定高于50病变累积阳性率-50/高于50病变累积阳性率-低于50病变累积阳性率.参照文献14,用细胞维持液将试验中药粗提物作连续的倍比稀释表1后,加到已长成MARC145细胞单层的细胞培养板上,每个稀释度重复8孔,另设细胞对照不加中药,置5CO2表13种中药粗提物的稀释倍数培养箱中37℃培养120H,每天观察细胞病变情况,以能长成或维持良好单层细胞的最高药物浓度作为药物的安全浓度,进行抗PRRSVPX株试验.TABLE1DILUTIONOF3CHINESEHERBALMEDICINE孔号药物质量浓度/MGML-1稀释倍数150000222500043125008462501653125326156364707821288039125690196512100098102411004920481243种中药粗提物抗PRRSVPX株试验以中药最大安全浓度为基准,用细胞维持液依倍比稀释成4个浓度,以如下3种方式研究3种中药粗提物抗PRRSVPX株的作用.1对PRRSVPX株的阻断作用.先加中药粗提物,后接病毒液.在细胞已基本长满的96孔细胞培养板上,加入从低浓度到高浓度稀释好的同一种中药粗提物,每孔100ΜL,每个浓度重复8孔.置5CO2培养箱中37℃培养4H后,加入100TCID50PRRSVPX株病毒液作用2H,再加入细胞生长液,每孔100ΜL,置5CO22对PRRSVPX株的抑制作用.先接PRRSVPX株病毒液,再加中药粗提物.用病毒液作用2H,再加药液作用4H,其他操作与1相同.培养箱中37℃培养72H.第36卷第4期曾强等3种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用4613对PRRSVPX株的直接灭活作用.中药粗提物与PRRSVPX株病毒液体外作用2H后,加入到培养液中.在小试管中,将中药粗提物原液稀释成不同的浓度,盖上盖子,置5CO2培养箱中37℃培养2H;将经处理的药液加入到已经长好细胞的细胞培养板孔中,置5CO2培养箱中37℃培养4H,加入含100TCID50病毒的培养基,每孔100ΜL,置5CO22结果与分析培养箱中37℃培养72H.上述3种作用方式试验均设置正常细胞对照组细胞对照,不加中药,不攻毒和PRRSVPX株接种对照组病毒对照,不加中药,攻毒.以上各组每天用显微镜观察CPE情况并记录,根据CPE和MTT试验结果判断药物的作用效果.MTT吸收法采用酶联免疫检测仪570NM/630NM双波长模式测定细胞OD值,以敏感波长与非敏感波长OD值之差作为中药粗提物抗PRRSVPX株感染细胞的指标,细胞OD值越大,抗PRRSVPX株效果越好.用SPSS115软件统计分析组间的差异性.21PRRSVPX株的TCID50由表2可知,病毒稀释度10测定结果-4的病变孔累积阳性率高于50,而10-6的低于50,50阳性率终点分布于两者之间,按公式计算得TCID5010-45,也就是说,病毒稀释度为10-45时,以01ML接种一组细胞孔后使50细胞感染,即50的细胞存在病变的可能,故该病毒感染的滴度为10-45表2PRRSVPX株不同稀释度TCID.50TABLE2测定结果TESTEDRESULTSOFTCID50病毒稀释度ATDIFFERENTDILUTEDCONCENTRATIONOFPRRSVPXSTRAINS接种孔数/个阳性孔数/个病变孔数/个积累孔数/个病变率/阳性阴性阳性阴性108-1880360100108-2880280100108-3880200100108-455312380108-54447750108-633531220108-70080200108-80080280223种中药粗提物的安全浓度天然药物毒性与其浓度呈正相关1517.从表3可知,试验药物浓度高于某一值时都会对MARC145细胞产生毒性作用,使细胞产生病变,且随着其浓度的增加,所产生的毒性作用愈强,细胞的病变愈严重.当板蓝根、甘草、鱼腥草的质量浓度由50MG/ML分别降至3125、3125、1563MG/ML时,MARC145细胞基本不产生病变,即没有表现出毒性,故此质量浓度为最大安全浓度.通常情况下,药物与毒物只有量的差别,而无质的区别,中药也是如此,使用太多或超量使用也可引起毒副反应18表3中药粗提物对MARC145细胞作用的安全浓度,因此,进行抗病毒试验时,要从试验药物最大安全浓度开始稀释,以排除中药本身引起的细胞病变效应的干扰,保证试验结果的正确、可靠.TABLE3SAFETYCONCENTRATIONOFEXTRACTSOFCHINESEHERBALMEDICINESONMARC145中药药物不同质量浓度MG/ML下的细胞病变情况细胞对照50000250001250062503125156307820391019600980049板蓝根--------甘草--------鱼腥草-------细胞病变75~100记为“”,50~75记为“”,25~50记为“”,0~25记为“”;基本无病变记为“-”.下同.233种中药粗提物对抗PRRSVPX株的阻断作用中药中的黄酮类、多糖及其衍生物、三萜类化合物及其衍生物如甘草甜素衍生物、生物碱及苷类等,都通过阻止病毒颗粒对宿主细胞的吸附而发挥抗病毒作用1920.由表4、表5可知,3种中药粗提物对抗PRRSVPX株均有不同程度的阻断作用.3125MG/ML板蓝根、0391MG/ML甘草、0782MG/ML鱼腥草的阻断作用最好,与病毒对照差异显著P<005,对细胞保护效果好,与细胞对照差异不显著.这可能是先加药后接病毒,中药粗提物的462湖南农业大学学报自然科学版2010年8月某些有效活性成分增强了细胞膜的稳定性,阻止了病毒颗粒吸附靶细胞,使感染细胞受到保护,提高了抗病毒感染能力.表43种作用方式的各组细胞病变效应TABLE4CPEOFCELLTREATEDBYPRECAUTION,INHIBITIONANDDIRECTKILLINGAGAINSTPRRSVPX处理阻断作用抑制作用直接灭活作用板蓝根甘草鱼腥草板蓝根甘草鱼腥草板蓝根甘草鱼腥草A-1A2-A3A4-病毒对照细胞对照---------A1A4示不同质量浓度板蓝根分别为3125,1563,0782,0391MG/ML;甘草分别为3125,1563,0782,0391MG/ML;鱼腥草分别为1563,0782,0391,0196MG/ML中药粗提物处理.下同.表53种作用下测得各组细胞的OD值TABLE5ODVALUESOFTHECELLTREATEDBYPRECAUTION,INHIBITIONANDDIRECTKILLINGAGAINSTPRRSVPX处理阻断作用OD值板蓝根甘草鱼腥草A02850018B102130037A02570013BA01750042C202310036AB02650011BA01990063C302330031AB02480022BA00780008D402440035B01460022C病毒对照01270020A01880018A01860013A细胞对照02830024B02460014B02660025B处理抑制作用OD值板蓝根甘草鱼腥草A02340029C102050016DF02280019CDA02010021D202260037C02410034DA00860015A302330019C02020030CA00760010A402260028CF02050022C病毒对照00650009A01830028AD01110006A细胞对照03310036B04190032B03990040B处理直接灭活作用OD值板蓝根甘草鱼腥草A04790043B103580049A01840014AA04910052B203510020A01640011AA03110063C303900031C01450011CA03890028A403720020AC01550012C病毒对照04090039A03360030A01770018A细胞对照05200030B04750018B04000036B243种中药粗提物对PRRSVPX株的抑制作用中药中的多酚类物质,可以抑制流感病毒蛋白质和RNA的合成,也可以抑制流感病毒的吸附作用21253种中药粗提物对PRRSVPX株的直接灭活作用.由表4、表5可知,3种中药粗提物对PRRSVPX株均有不同程度的抑制作用.板蓝根、甘草、鱼腥草分别在质量浓度3125、0782、0782MG/ML时的抑制作用最强,与病毒对照和细胞对照差异显著P<005,对细胞有一定的保护效果.可见,3种中药抑制作用较其阻断作用效果差.这可能是接种病毒后,已侵入的病毒对细胞产生破坏,加入中药粗提物后,粗提物的有效成分干扰病毒的复制,从而抑制病毒增殖,产生抗病毒感染的抑制作用.板蓝根对疱疹病毒有杀灭作用,而非抑制作用10甘草甜素对带状疱疹病毒具有直接杀灭作用22P<005;板蓝根对细胞的保护效果最好,与细胞对照差异不显著;鱼腥草对PRRSVPX株没有直接灭活作用,与病毒对照差异不显著,表明板蓝根、甘草可能含有促进抗病毒抗体生成的有效活性成分,但哪种成分占主要地位,是对单一靶点作用还是对不同部位协同作用,在临床上是否可以作为治疗药物等还有待研究..由表4、表5可知,1563MG/ML板蓝根、0782MG/ML甘草的直接灭活作用最好,与病毒对照差异显著3结论与讨论采用体外细胞培养的方法,测得板蓝根、甘草和鱼腥草粗提物对MARC145细胞的最大安全浓度分别为3125、3125、1563MG/ML,病毒感染的滴度TCID50为10-45.3种单一味中药粗提物对第36卷第4期曾强等3种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用463PRRSVPX株均有不同程度的阻断和抑制作用,3125MG/ML板蓝根、0391MG/ML甘草、0782MG/ML鱼腥草的阻断作用最好,3125MG/ML板蓝根、0782MG/ML甘草、0782MG/ML鱼腥草的抑制作用最好,1563MG/ML板蓝根、0782MG/ML甘草的直接灭活作用最好,与病毒对照差异显著P<005,鱼腥草对PRRSVPX株没有直接灭活作用.综合比较3种中药粗提物体外抗PRRSVPX株感染细胞的作用,板蓝根的效果最好.板蓝根、甘草、鱼腥草可作为抗PRRSVPX株的预防用药,但其效果有待进一步研究.参考文献1王学斌,魏战勇,崔保安,等.板蓝根、黄芪对猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外抑制作用J.畜牧与兽医,2006,3841114.2MENGELINGWL,LAGERKM,VORWALDAC.SAFETYANDEFFICACYOFVACCINATIONOFPREGNANTGILTSAGAINSTPOCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEJ.VETRES,1999,607796801.3BOTNERA,NIELSENJ,OLEKSIEWICZMB,ETAL.HETEROLOGOUSCHALLENGEWITHPORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEPRRSVACCINEVIRUSNOEVIDENCEOFRECTIVATIONOFPREVIOUSEUROPEANTYPEPRRSVIRUSINFECTIOUSJ.VETMICROBIOL,1999,683/4187195.4NIELSENTL,NIELSENJ,HAVEP,ETAL.EXAMINATIONOFVIRUSSHEDDINGINSEMENFROMVACCINATEDANDFROMPREVIOUSLYINFECTEDBOARSAFTEREXPERIMENTALCHALLENGEWITHPORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUSJ.VETMICROBIOL,1997,542101112.5NILUBOLD,PLATTKB,HALBURPG,ETAL.THEEFFECTOFAKILLEDPORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUSPRRSVVACCINETREATMENTONVIRUSSHEDDINGINPREVIOUSLYPRRSVINFECTEDPIGSJ.VETMICROBIOL,2004,1021/21118.6毋安雄,濮文正,蒋建一,等.4种猪生殖和呼吸综合征灭活疫苗免疫效果比较J.中国兽医杂志,2003,3991819.7张红英,崔保安,王学兵,等.2种植物多糖对PRRSV灭活苗免疫猪抗体及T淋巴细胞亚群的影响J.湖南农业大学学报自然科学版,2010,362210214.8秦华珍,时博,李世阳,等.南板蓝根和北板蓝根抗甲型流感病毒作用的比较研究J.中华中医药学刊,2009,271168169.9史利田.抗呼吸道病毒中药的实验研究述评J.中国中医基础医学杂志,1998,12454.10张其威,张楚瑜.抗病毒中药研究的最新进展J.中成药,2005,271116119.11颜其贵,郭万柱,陈斌,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株的分离鉴定J.畜禽业,20061569.12王向阳,刘志苏,姜合作,等.金丝桃素体外抗巨细胞病毒效应的实验研究J.武汉大学学报医学版,20065302306.13殷震,刘景华.动物病毒学M.2版.北京科学出版社,1997189210.14BOERNFUNDE,BABICHH,MARTINALGUACILN.COMPARISONOFTWOINVITROCYOTOXICITYASSAYSTHENEUTRALREDNRANDTETRAZOLIUMMTTTESTSJ.TOXICOLOGYINVITRO,1988216.15刘家国,胡元亮,陈玉库,等.几种天然药物成分在体外CEF中最大安全浓度的测定J.动物医学进展,2002,2338892.16刘家国,胡元亮,陈玉库,等.天然复方药物在CEF上的安全浓度筛选及其抗IBDV感染的试验研究J.中兽医医药杂志,200251215.17胡元亮,孔祥峰,张宝康.10种中药成分对鸡胚成纤维细胞生长的影响J.中国兽医学报,2003,236601603.18艾国良.中药饲料添加剂提高母猪繁殖性能的研究J.湖南农业大学学报自然科学版,2007,332196199.19许小琴,申海青,韦旭斌.中药抗病毒实验药理学研究现状与展望J.中兽医医药杂志,2004448.20付秀花,王恬,顾宏伟.中药的免疫增强作用J.畜牧与兽医,2002,3484042.21杨海燕,张传美,杜绍范,等.抗流感病毒中药研究进展J.辽宁畜牧兽医,2004339.22李铁民,梁再赋.甘草提取物及其衍生物的抗病毒研究现状J.中药,1994,2512655658.责任编辑王赛群英文编辑罗文翠3种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用作者曾强,黄良宗,李丹,朱燕秋,谢海燕,顾万军,ZENGQIANG,HUANGLIANGZONG,LIDAN,ZHUYANQIU,XIEHAIYAN,GUWANJUN作者单位曾强,黄良宗,李丹,顾万军,ZENGQIANG,HUANGLIANGZONG,LIDAN,GUWANJUN佛山科学技术学院,生命科学学院,广东,佛山,528231,朱燕秋,谢海燕,ZHUYANQIU,XIEHAIYAN东莞市动物疫病预防控制中心,广东,东莞,523107刊名湖南农业大学学报(自然科学版)英文刊名JOURNALOFHUNANAGRICULTURALUNIVERSITYNATURALSCIENCES年,卷期2010,364被引用次数0次参考文献22条1许小琴;申海青;韦旭斌中药抗病毒实验药理学研究现状与展望2004042艾国良中药饲料添加剂提高母猪繁殖性能的研究期刊论文湖南农业大学学报自然科学版2007023胡元亮;孔祥峰;张宝康10种中药成分对鸡胚成纤维细胞生长的影响期刊论文中国兽医学报2003064史利田抗呼吸道病毒中药的实验研究述评1998045秦华珍;时博;李世阳南板蓝根和北板蓝根抗甲型流感病毒作用的比较研究2009016张红英;崔保安;王学兵2种植物多糖对PRRSV灭活苗免疫猪抗体及T淋巴细胞亚群的影响期刊论文湖南农业大学学报自然科学版2010027毋安雄;濮文正;蒋建一4种猪生殖和呼吸综合征灭活疫苗免疫效果比较2003098NILUBOLD;PLATTKB;HALBURPGTHEEFFECTOFAKILLEDPORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUSPRRSVVACCINE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