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cRGD-氧化铁纳米粒的构建及应用于核磁共振成像诊断中的动物研究.pdf

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cRGD-氧化铁纳米粒的构建及应用于核磁共振成像诊断中的动物研究.pdf

肿瘤2010年4月第3O卷第4期TUMORVO1.30,NO.4,APRIL,2010277DOI10.3781/J.ISSN.10007431.2010.04.003BASICRESEARCH基础研究CRGD氧化铁纳米粒的构建及应用于核磁共振成像诊断中的动物研究丁永梅,周彩存,赵印敏,李玮,孟淑燕同济大学附属上海市肺科医院肿瘤科,上海200433摘要目的构建肿瘤靶向的核磁共振成像MAGNETICRESONANCEIMAGING,MRI阴性造影剂纳米粒,并初步探讨其在肿瘤MRI中的应用。方法化学共沉淀一步法制备超小型超顺磁性氧化铁UHRASMALLSUPERPARAMAGNETICIRONOXIDE.USPIO纳米粒。采用化学交联法将含有精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸ARGGLYASP,RGD序列的环形短肽CYCLICRGD,CRGD与USPIO共价结合,制备具有整合素靶向作用的超顺磁性造影剂,并对其进行理化性质的检测。采用普鲁士兰染色法检测CRGDUSPIO和USPIO与人肺腺癌A549细胞及人脐静脉内皮细胞HUMANUMBILICALVEINENDOTHELIALCELLS,HUVECS的特异性结合能力。建立A549裸鼠移植瘤模型,尾静脉注射USPIO和CRGDUSPIO,行MRI检测,评价CRGDUSPIO对肿瘤MRI信号增强的作用。结果成功制备获得CRGDUSPIO纳米粒,其核心纳米粒径为510NM,平均粒径为43.9710.10NM,比饱和磁化强度为59.94AMKG~。细胞结合实验结果提示,与USPIO组比较,CRGDUSPIO组阳性染色明显增强。动物体内MRI诊断结果显示,与USPIO组比较,CRGDUSPIO组肿瘤信号明显降低P0.O1。结论构建的靶向性超顺磁性氧化铁纳米粒可能成为一种新型的、具有肿瘤早期诊断特异性的MRI阴性造影剂。关键词癌;纳米技术;磁共振成像;早期诊断中图分类号R730.4文献标志码A文章编号1000.7431201004027706CONSTRUCTIONOFCRGDIRONOXIDENANOPARTICLESANDITSAPPLICATIONINTHETUMORDIAGNOSISBYMAGNETICRESONANCEIMAGINGDINGYONGMEI,ZHOUCAICUN,ZHAOYINMIN,LIWEI,MENGSHUYANDEPARTMENTOFONCOLOGY,SHANGHAIPULMONARYDISEASESHOSPITAL,TONGJIUNIVERSITY,SHANGHAI200433,CHINAABSTRACTOBJECTIVETOCONSTRUCTSUPERPARAMAGNETICIRONOXIDENANOPARTICLESTARGETINGTUMORANGIOGENESISANDEVALUATETHEIRPOTENTIALVALUEASCONTRASTAGENTINMAGNETICRESONANCEIMAGINGMRI.METHODSUHRASMALLSUPERPARAMAGNETICIRONOXIDEUSPIONANOPARTICLESTARGETINGTUMORANGIOGENESISWEREPREPAREDBYUSINGCOPRECIPITATIONCHEMICALMETHOD.CYCLICRGDCRGDCONTAININGTHESEQUENCEOFARGGLYASPWERECONJUGATEDUSPIONANOPARTIELESBYUSINGCHEMICALEONJUGATIVEMETHODTOPREPARESUPERPARAMAGNETICIMAGINGAGENTTARGETINGTUMORANGIOGENIEVESSLES.THEPHYSICALANDCHEMICALPROPERTIESOFCRGDUSPIONANOPARTICLESWEREDETECTED.THESPECIFICBINDINGCAPABILITIESOFERGD.USPIOANDUSPIOTOHUMANLUNGADENOEARCINOMACELLSA549ANDHUMANUMBILICALVEINENDOTHELIALCELLSHUVECWERETESTEDBYPRUSSIANBLUESTAINING.A549XENOGRAFTSWEREESTABLISHEDINNUDEMICE,THENUSPIOANDCRGDUSPIOWEREINJECTEDTHOUGHTAILVEIN,ANDTHEMRISIGNALENHANCEMENTEFFECTOFCRGDUSPIOWASEVALUATED.RESULTSWESUCCESSFULLYPREPAREDTHECRGDUSPIONANOPARTICLES.ITSCOREDIAMETERWAS510NMANDTHEAVERAGEDIAMETERWAS43.97410.10AMANDTHEQUALITYSATURATIONMAGNETICINTENSITYWAS59.94AMKG一.CELLBINDINGTESTSUGGESTEDTHATCRGDUSPIOGROUPSHOWEDSTRENGTHENEDPOSITIVESTAINING./NVIVOMRIEXPERIMENTSSHOWEDTHATSIGNALSOFTUMORWERESIGNIFICANTLYREDUCEDINCRGDUSPIOGROUPTHANTHATINUSPIOGROUPP0.01.CONCLUSIONTHECONSTRUCTEDCRGD.USPIONANOPARTICLESCANBEDEVELOPEDASAPOTENTIALTUMORSPECIFICMRICONTRASTAGENTFORTHEEARLYDIAGNOSISOFCANCER.KEYWORDSCARCINOMA;NANOTECHNOLOGY;MAGNETICRESONANCEIMAGING;EARLYDIAGNOSISTUMOR,2010,304277282肿瘤的早诊断早治疗对提高肿瘤的治愈率和降低肿瘤患者的死亡率有很重要的意义。影像学检查是肿瘤早期诊断的重要手段之一。磁共振成像MAGNETICRESONANCEIMAGING,MRI方法因具有较高基金项目1.国家高科技研究发展计划863计划项目编号2008AA02Z4422.上海市科学技术委员会科研计划资助项目编号0752NM018CORRESPONDENCETOZHOUCAICUN周彩存EMAILCAICUNZHOUYAHOO.CORN.CN的空间分辨率,可全面显示被检查器官或组织的结构,而被广泛应用于临床诊断。为了进一步提高MRI对软组织的分辨率,使一些微小病灶显影更加清晰,可采用MRI造影剂增强图像的对比度。超顺磁性氧化铁SUPERPARAMAGNETICIRONOXIDE,SPIO是一种磁共振MAGNETICRESONANCE,MR阴性造影剂。SPIO颗粒进入外加磁场后,呈不均匀分布,造成局部磁场的不均匀,产生磁化效应,从而加速了质子去相位的T2弛豫,使组织信号降低,而对T1弛豫影响较小。经过多年的研究,SPIO已被应用于细胞追278肿瘤2010年4月,第30卷踪、药物运载、肿瘤诊断以及其他不同领域。J。由于目前制备获得的SPIO粒径大,易被肝脾内皮网状系统吞噬,且缺乏特异性,因此超小型超顺磁性氧化铁UHRASMALLSUPERPARAMAGNETICIRONOXIDE,USPLO纳米粒的研制将更有利于提高SPIO纳米粒应用的稳定性。研究发现,整合素INTEGRIN在新生血管内皮细胞表面和多种肿瘤内皮细胞表面高表达J。含有精氨酸.甘氨酸.天冬氨酸ARGGLYASP,RGD序列的蛋白和多肽可被整合素、,特异性识别并结合,进而调控肿瘤血管的形成、肿瘤的生长和转移。本研究将含有RGD序列的环形多肽CYCLICRGD,CRGD与USPIO纳米粒共价结合,制备具有肿瘤靶向性的MRI造影剂CRGD.USPIO,探讨其在肿瘤早期特异性诊断中的价值和意义。1材料与方法1.1主要试剂与材料六水三氯化铁A6H2O,相对分子质量270.30、二水氯化亚铁FEC14}{2O,相对分子质量198.71、亚铁氰化钾KFECN,相对分子质量329.24、葡聚糖T40DEXTRANT40,相对分子质量40000、邻菲罗啉C。HNHO,相对分子质量198.22和硫酸亚铁铵NHFESO6HO,相对分子质量392.14等均购于国药集团化学试剂有限公司。CRGD多肽由托吉尔生化上海有限公司合成,琼脂糖凝胶CL4B为北京鼎国生物技术有限责任公司产品。人脐静脉内皮细胞HUMANUMBILICALVEINENDOTHELIALCELLS,HUVECS和肺腺癌A549细胞由上海肺科医院中心实验室提供。SPF级4周龄BALB/C裸鼠购自斯莱克动物实验中心,饲养许可证号为SCXK沪20030003。1.2主要设备852恒温磁力搅拌器国华电器有限公司,H2050R高速冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司,CO培养箱SANYO公司,OLYMPUSCKX41倒置显微镜OLYMPUS公司,JY92一Ⅱ超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司,JEM一1200EXI1型透射电子显微镜日本JEOL公司,紫外分光光度计上海第三分析仪器厂,MASTERSIZER2000激光粒度仪英国MALVERN公司,超滤离心管AMICONULTRA美国MILLIPORE公司,细胞培养瓶、多孔培养板丹麦NUNC公司,针式滤器MILLEXFH和透析袋截留相对分子质量140002OOO美国UNIONCARBIDE公司。1.3USPIO的制备采用化学共沉淀一步法制备葡聚糖包裹的四氧化三铁纳米颗粒。具体步骤物质的量之比为21的FEC136H2O和FEC124H2O溶于含21%DEXTRANT40的去离子水溶液中充氮气,不断搅拌1000~1200R/MIN,温度70℃,滴加25%的氨水调节反应溶液PH值10,反应1H;停止反应后得到黑色液体,冷却后4000XG离心10RAIN,弃去沉淀,保留上清液,加入适量的冰乙酸调节溶液PH值至7.4;超声振荡5MIN,反应液灌入透析袋中透析24H,每2H更换一次透析液,透析后的反应液经过琼脂糖凝胶色谱柱分离纯化,置超滤离心管,4000XG离心30MIN,收集滤液4CC保存备用。1.4CRGDUSPIO的制备吸取0.5MLUSPIO纳米粒,加入0.5MLNALO0.1MOL/L和0.2MOL/L的乙酸钠溶液,室温条件下避光搅拌反应1H。用超滤离心管迅速分离NALO与乙酸钠溶液,用0.1MOL/LNAHCO溶液调节反应溶液的PH值到8.0,加入CRGD多肽多肽与葡聚糖的物质的量之比为31,常温下搅拌反应4H,加入新鲜配制的1%NABH溶液1ML,再反应15MIN,随后将溶液置于透析袋中,采用透析法去除NAHCO和NABH。最后将透析液经过琼脂糖凝胶CL4B层析柱,去除游离多肽,制备获得CRGD.USPIO。1.5物理性质检测1.5.1形态学观察和粒径分布的检测光学显微镜下观察USPIO和CRGDUSPIO的形态将CRGDUSPIO0.2ML滴加在载玻片上,置光学显微镜下X400观察。透射电子显微镜观察将0.1MLCRGDUSPIO用0.9%氯化钠溶液稀释至5ML,取1O稀释后的CRGDUSPIO液滴于铜网上,吸去多余液体,室温下干燥后,置透射电子显微镜下观察形态。采用激光散射粒度分析仪测定USPIO和CRGDUSPIO的粒径分布。1.5.2振动样品磁强计检测比饱和磁化强度制备获得的CRGDUSPIO经真空冷冻干燥后,置于特制容器中,逐渐加大磁场强度,观察磁化曲线,直至样品的磁化强度不再增加为止。记录磁化曲线相关数据,处理后得到比饱和磁化强度。1.5.3CRGD.USPIO中铁含量的检测CRGDUSPIO中铁含量的检测采用邻二氮菲法检测,精密吸取CRGDUSPIO溶液0.5ML加入10ML的盐酸6MOL/L溶液,置于100ML容量瓶中,加纯水稀释至刻度,摇匀。再精密吸取上述配制的溶液1ML,置于50ML的容量瓶中,依次加入1ML10%的盐酸羟第4期.丁永梅,等.CRGD.氧化铁纳米粒的构建及应用于核磁共振成像诊断中的动物研究281的早期筛查方法。近年来随着MRI在各领域的快速发展和应用,在医学领域已成为先进的成像系统,也是能发现早期癌变的成像设备J。MRI造影剂可进一步增强图像对比度,使微小病灶显影更加清晰。SPIO如FERUMOXIDES和FERUCARBOTRAN是临床上常用的MR阴性造影剂,由葡聚糖包裹铁离子FE和FE构成,摄人体内后可被降解为铁离子进入体内的铁代谢池J,对细胞正常代谢和生长有着重要的意义。葡聚糖的基本组成单位是葡萄糖,在其分子长链上分布着大量的醇羟基,在适当条件下氧化后,羟基变为化学活性较强的醛基,和许多药物及化学试剂上的官能团反应,生成具有特殊作用的前体药物和药物载体等,以提高药物的体内稳定性和生物利用度J。与其他造影剂相比,SPIO因使用剂量少、安全、不良反应小,故受到广泛的关注。但SPIO粒径较大,进入血液后主要被肝脾的网状内皮系统摄取,在其他组织中几乎找不到其分布,因此目前临床上局限用于肝脾造影。目前,已有学者致力于USPIO的研究,与SPIO平均粒径80~150NM相比,USPIO的粒径更小平均粒径50NM,较小的粒径和较厚的包裹层,使其与血浆蛋白和调理素的作用减弱,故不容易被肝脾的网状内皮细胞所摄取,在血浆中可停留较长时间,更易通过毛细血管壁,从而具备广泛的组织分布。有研究报道分别用SPIO和USPIO与人类单核细胞反应,结果提示单核细胞对USPIO的摄取量明显低于对SPIO的摄取量’MJ。MATUSZEWSKI等的研究也得出相似的结果,即细胞对磁性纳米颗粒的摄取量与其粒径呈负相关。目前研究表明,肿瘤的生长和转移有赖于血管生成,缺乏血管生成的实体瘤体积一般不会超过1~2MM。正常成熟组织毛细血管内皮细胞处于静止状态,而肿瘤血管内皮细胞增殖活跃,出现许多相对特异性的标志分子,如血管内皮生长因子受体VASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTOR,VEGF、整合素仪受体、人E选择素ESELECTIN和TIE受体等,它们的表达较正常静止内皮细胞高50倍以上,故为肿瘤靶向药物的制备提供了良好的靶点。研究表明,整合素D、,在肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞中高表达,RGD三肽序列是整合素仅、,受体的特异性配体,两者相结合可介导肿瘤细胞黏附和移行,在肿瘤生长、局部浸润和转移,特别是肿瘤诱导的血管生成过程中发挥重要作用,可被应用于肿瘤靶向的显影剂和肿瘤治疗药物。含有RGD的多肽有多种空间构象线性、环形,不同的构象其活性不同。HAUBNER等研究发现,环形结构RGD多肽比线性结构RGD多肽具有更好的稳定性、亲和性和受体特异性。故本实验选用的RGD短肽含有2个半胱氨酸DGARYCRGDCFDG,半胱氨酸缩合后形成一个二硫键,使其成为环形结构,含有该结构的CRGD多肽具有更好的稳定性及亲和性。在体外细胞实验中,通过普鲁士蓝染色均可见CRGDUSPIO在HUVECS和A549细胞中大量聚集,而USPIO在2种细胞中几乎没有聚集,由此可见CRGDUSPIO具有肿瘤特异性。USPIO的成像窗期非常宽,一般只要磁化铁心未被溶酶体破坏,其磁化特性及造影性能仍将保持完整。MIYOSHI等用氧化铁纳米粒标记造血干细胞,注入正常鼠体内后L4、24和48H分别行扫描,结果表明骨髓在24H和48H后信号强度降低。TRIVEDI等报道在注射USPIO后行巨噬细胞MRI扫描,结果显示24~36H后成像效果最佳,48H后下降,96H时仍可显像。根据上述研究结果,本实验选择了24H作为荷瘤动物MRI的研究点。本研究中体内实验检测结果显示,尾静脉给予CRGDUSPIO和USPIO后,荷瘤裸鼠MRI图像均可见信号降低,其中USPIO组的信号强度降低值为315.76469.85,而CRGDUSPIO组的信号强度降低值为792.17116.51,为USPIO组信号强度降低值的2.5倍,在MRI图中表现为肿瘤局部信号强度明显降低。这说明了与USPIO组相比,CRGDUSPIO因连接有可与肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞高表达的整合素仅、,特异性结合的CRGD,通过配体.受体特异性结合的途径聚集于肿瘤病灶,并在肿瘤病灶内停留较长的时间,从而在MRI扫描时,使肿瘤病灶信号强度明显降低,与周围组织的对比更加明显,进而可增加早期肿瘤的检出率。因此,本实验成功制备了肿瘤新生血管靶向的CRGDUSPIO。该纳米粒具有良好的理化性质,是较理想的肿瘤早期诊断造影剂,为肿瘤分子影像诊断提供了新思路和新技术手段,具有广阔的潜在的应用前景。参考文献1LUJ,MAS,SUNJ,ETA1.MANGANESEFERRITENANOPARTICLEMICELLARNANOCOMPOSITESASMRICONTRASTAGENTFORLIVERIMAGINGJ.282肿瘤2010年4月,第3O卷2345678910BIOMATERIALS,2009,301529192928.NASONGKLAN,BEYE,RENJ,ETA1.MUHIFUNCTIONALPOLYMERICMIEELLESASCANCERTARGETED,MRIUHRASENSITIVEDRUGDELIVERYSYSTERNSJ.NANOLETT,2006,61124272430.DEVRIESIJ,LESTERHUISWJ,BARENTSZJO,ETA1.MAGNETIERESONANCETRACKINGOFDENDRITICCELLSINMELANOMAPATIENTSFORMONITORINGOFCELLULARTHERAPYJ.NATBIOTECHNOL,2005,2311L4071413.ZITZMANNS,EHEMANNV,SCHWABM,ETA1.ARGININEGLYCINEASPARTICACIDRGD一PEPTIDEBINDSTOBOTHTUMORANDTUMORENDOTHELIALCEILSINVIVOJ.CANCERRES,2002,621851395】43.HARRISTD,KALOGER0P0UL0USS,NGUYENT,ETO1.DESIGN,SYNTHESIS,ANDEVALUATIONOFRADIOLABELEDINTEGRINALPHAVBETA3RECEPTORANTAGONISTSFORTUMORIMAGINGANDRADIOTHERAPYJ.CANCERBIOTHERRADIOPHARRN,2003,184627641.杨玉东,于忠淇,潘卫三,等.超顺磁性造影剂的研究进展J现代生物医学进展,2007,7913871390.WEISSLEDERR,STARKDD,ENGELSTADBL,ETA1.SUPERPARAMAGNETIEIRONOXIDEPHARMAEOKINETIESANDTOXICITYJ.AM,ROENTGENOL,1989,1521167173.YUDOVINFARBERI,AZZAMT,METZERE,ETA1.CATIONICPOLYSACEHARIDESASANTIPROTONAGENTSJ.MEDCHEM,2005,48514141420.METZS,BONATERRAG,RUDLIUSM,ET.CAPACITYOFHUMANMONOCYTESTOPHAGOCYTESAPPROVEDIRONOXIDEMRCONTRASTAGENTSINVITROJ.EURRADIOL,2004,141O18511858.OUDEENGBERINKRD,VANDERPOLSMA,DOPPEA,ETA/.““””“卜“卜.”卜卜””“肿瘤杂志荣获COMPARISONOFSPIOANDUSP10FORINVITROLABELINGOFHUMANMOBOCYTESMRDETECTIONANDCELLFUNCTIONJ.RADIOLOY,2007,2432467.474.11MATUSZEWSKIL,PERSIGHLT,WALLA,ETA1.CELLTAGGINGWITHCLINICALLYAPPROVEDIRONOXIDESFEASIBILITYANDEFFECTOFLIPOFEETION,PARTICLESIZE,ANDSURFACECOATINGONLABELINGEFFICIENCYJ.RADIOLOGY,2005,2351155161.12粟波,徐清华,周崧雯,等.靶向肿瘤新生血管的顺磁性纳米脂质体在MRI诊断肺癌中的研究J.肿瘤,2008,286494497.13HAUBNERR,BRUCHERTSEIFERF,POCKM,ETO1.SYNTHESISANDBIOLOGJICALEVALUATIONOFA99MTCLABELEDCYCLICRGDPEPTIDEFORIMAGINGTHEALPHAVBETA3EXPRESSIONJ.NUCLEARMEDIZIN,2004,4312632.14HOLIGP,BACHM,VOLKELT,ETO1.NOVELRGDLIPOPEPTIDESFORTHETARGETINGOFLIPOSOMESTOINTEGRINEXPRESSINGENDOTHELIALANDMELANOMACELLSJ.PROTEINENGDESSEL,2004,1754334_41.15MIYOSHIS,FLEXMANJA,CROSSDJ,ETO1.TRANSFECTIONOFNEUROPROGENITORCELLSWITHIRONNANOPARTIELESFORMAGNETICRESONANCEIMAGINGTRACKINGCELLVIABILITY,DIFFERENTIATION,ANDINTRAEELLULARLOCALIZATIONJ.MOLIMAGINGBIOL,2005,74289295.16TRIVEDIRA,UKINGIMJM,GRAVESMJ,ETA1.INVIVODETECTIONOFMACROPHAGESINHUMANCAROTIDATHEROMATEMPORALDEPENDENCEOFUHRASMALLSUPERPARAMAGNETIEPARTICLESOFIRONOXIDEENHANCEDMRIJ.STROKE,2004,35716311635.收稿日期20091020修回日期20091216本文编辑林琳“””“““”“””””..””“”“第4届读者作者编者华东地区优秀科技期刊称号2009年11月,在华东地区各省市新闻出版局联合组织的“第4届华东地区优秀期刊评选活动”中,肿瘤杂志荣获“第4届华东地区优秀科技期刊”称号。该评选活动旨在发挥优秀期刊在期刊出版事业中的示范作用,带动华东地区期刊整体质量的提高,推动期刊出版的繁荣发展。经评委会严格筛选,上海市此次共有54种科技期刊入选。本刊编辑部

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