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FISH 检测快速诊断曲霉菌感染的临床价值.pdf

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FISH 检测快速诊断曲霉菌感染的临床价值.pdf

第19卷第4期2010年08月中国组织化学与细胞化学杂士JL■、CHINESEJOURNALOFHISTOCHEMISTRYANDCYTOCHEMISTRYV01.19.NO.4AUGUST.2010FISH检测快速诊断曲霉菌感染的临床价值孟浦1肖晶1潘峰1聂秀1周东风1何世斌2李立家1华中科技大学同济医学院附属协和医院儿科,武汉430022;2武汉大学生命科学学院.武汉430072摘要目的探讨荧光原位杂交技术FISH检测曲霉菌感染的可行性和特异性。以期早期病原学诊断I临床真菌感染。方法采用地高辛末端标记的18SL寡核苷酸探针与27例经HE及PAS染色诊断为口R疑真菌感染的石蜡包埋组织切片进行FISH检测。结果HE及PAS染色.口F疑真菌感染分别为23例和27例。27例町疑真菌感染标本14例检出FISH阳性信号。结论FISH町以特异性地检测出组织石蜡切片中的曲霉菌,设计不同菌属探针进行靶DNA杂交可以快速检测各种临床标本中的真菌感染,从而作为IFI早期病原学诊断的一种新策略。关键词曲霉菌;荧光原佗杂交;寡核苷酸探针;侵袭性真菌感染;早期诊断中图分类号Q781文献标识码ADOI10.3870/ZGZZH】‘.2010.04.003ALLNLALⅥ址UEOFF1SHINTHED朗唾CNONOFASPERGII上USD唾咖ONFORRAPIDD队GNOSLSMENGPU卜,XIAOJIN91,PANFEN91,NIEXIUL,ZHOUDONGFEN91,HESHIBIN2,LILIJIA21UNIONHOSPITAL,丁0行GJIMEDICALCOLLEGE,HUAZHONGUNIVERSITYOFSCIENCEANDTECHNOLOGY,WUHAN430022;2COLLEGE0FLIFESCIENCE,WUHANUNIVERSITY,WUHAN430072,CHINAABSTRACT30BJECTIVETOEVALUATETHEPROSPECTOFFLUORESCENCEINSITUHYBRIDIZATIONFISHTECHNOLOGYINTHEDIAGNOSISOFPEDIATRICINVASIVEFUNGALINFECTIONS.METHODS23一BASEPAIROLIGONUCLEOTIDES,WHICHWERECOMPLEMENTARYTO18S18S1PROBESRRNAOFASPERGILLUSANDLABELEDWITHDIGOXIGENINDIGWEREUSEDASPROBES.27FORMALINFIXEDANDPARAFFINEMBEDDEDSURGICALTISSUESPECIMENSFROMPATIENTSWITHSUSPECTEDFUNGALINFECTIONWEREINCLUDEDINTHISRESEARCH.THENTHESETISSUESPECIMENSWERESTAINEDWITHHEANDPASSIMULTANEOUSLY.RESULTS14EANDPASSTAININGSSHOWEDSUSPECTEDFUNGALINFECTIONIN23CASESAND27CASES.FISHFORASPERGILLUSRDNAWASPOSITIVEIN14CASESUSINGTHE18SLPROBE.CONCLUSIONFISHCANDETECTASPERGILLUSHYPHALELEMENT々INTHEFORMALIN..FIXEDANDPARAFFIN.EMBEDDEDTISSUESPECIMENSANDISAUSEFULMETHODTORAPIDLYANDACCURATELYIDENTIFYASPERGILLUSINTISSUES.KEYWORDS3ASPERGILLUS;FLUORESCENCEINSITUHYBRIDIZATION;0LIGONUCLEOTIDEPROBES;INVASIVEFUNGALINFECTIONS;EARLYDIAGNOSIS侵袭性真菌感染INVASIVEFUNGALINFECTIONS,IFI是指侵袭深部组织的真菌感染和真菌血症,包括霉菌和酵母菌感染1。近年来,随着侵入性诊疗手段的运用,免疫抑制剂和广谱抗生素的使用,以及各种大型手术的广泛开展,深部真菌感染尤其是曲霉菌感染的发生率呈上升趋势。IFI临床表现缺乏特异性,早期诊断困难,死亡率高达15%2。因此早期病原学诊断以期达到抢先治疗PREEMPTIVETHERAPY及靶向治疗对患者的预后至关重要。近年来,分子生物学检测已成为IFI早期诊断的研究热点之一。收稿日期20100210修回EL期20100401基金项目国家自然科学基金30771204作者简介孟浦,男1961年,汉族。副教授通讯作者TOWHOMCORRESPONDENCESHOULDBEADDRESSED荧光原位杂交FLUORESCENCEINSITUHYBRIDIZATION,FISH是一种非放射性分子细胞遗传技术,根据不同病原菌的DNA序列特点,设计出种属特异性的探针,用荧光染料标记,可以检测病原菌并快速鉴定菌种。作为分子病理学诊断方法,FISH已应用于检测并区分病理切片中的多种微生物。本研究选择针对曲霉菌属18SRRNA的寡核苷酸通用探针18S1E3|,利用FISH技术检测临床拟诊真菌感染的组织标本,初步探讨了其在临床早期诊断中的可行性和特异性。材料和方法1.样本制备实验组为我院2007年10月一2010年2月27例皮肤科、耳鼻喉科、血液科及肿瘤科等科室活检术后经福尔马林固定、石蜡包埋的病理科存档标本。万方数据332中国组织化学与细胞化学杂志第19卷所选标本病理表现为水肿,黄褐色沙状物,褐色豆渣样物,息肉样新生物,慢性炎症变化,霉菌块等。全部27例经病理检查均疑诊为真菌感染。阴性对照为12份病理诊断为非真菌感染的组织石蜡标本。每份石蜡标本连续切片3张。阳性对照为标准黑曲霉菌株F044,由武汉大学生命科学学院赠送,取标准曲霉菌株接种固体察氏培养基30℃培养3D,挑取菌落,制备福尔马林固定、石蜡包埋切片。另设空白对照由实验组和阴性对照各取1张切片。所有石蜡包埋切片二甲苯脱蜡,10070%系列乙醇水化。2.探针参考相关文献31制备针对曲霉菌基因组18SRRNA的寡核苷酸探针18孓1。探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,序列为5,GCGGGTCATCATAGAAACACCGCL3’,长度为23个碱基,地高辛末端标记。3.FISH参考周东风等4原位杂交方法并加以改良制备后的实验组切片样本经0.2MOL/LHCL室温处理10MIN;以蒸馏水冲洗后,蛋白酶K10肛G/M137℃消化30MIN;1TEBUFFER冲洗后,置于DNA杂交仪94℃加热5MIN,以灭活蛋白酶K;用新鲜卡诺固定液室温固定10MIN;1PBS洗5MIN3次,晾干。每张切片滴加50雎L杂交液,含有50%去离子甲酰胺,10%硫酸葡聚糖,20SSC,100NG//DDNA和50DENHART’S溶液,覆盖玻片,放入保湿皿中,置于DNA杂交仪95℃变性10RAIN,立即置于冰上1RAIN,再放人保湿皿中37℃杂交过夜。洗涤后滴加羊抗地高辛抗体ANTIDIGOXIGENINFITC,ROCHE,37℃孵育45MIN;1PBS室温洗5MIN3次;滴加兔抗羊地高辛偶联物RABBITANTISHEEPFITC,ROCHE,37℃孵育45MIN;1XPBS室温洗5MIN3次,晾干。玻片用含抗淬灭剂VECTORSHIELDVERTORLAB的DAPI4’,6DIAMIDINO2一PHENYLINDOLE复染,用OLYMPUSBX60显微镜观察杂交信号,用PHOTOMETRICSSENSYSCCD1400E照相装置和METAMORPH4.6.3UNIVERSALIMAGINGCROP.软件俘获图像,PHOTOSHOPCS9.0软件进行图片处理。阳性对照和阴性对照同上述方法行FISH检测。空白对照不加探针进行FISH检测。4.HE、PAS染色组织石蜡切片按照本院病理科染色方法进行HE、PAS染色。结果1.HE和PAS染色27例标本HE染色诊断可疑真菌感染23例,光镜下HE染色菌丝呈现红色,大部分着色不良,部分组织显示真菌的菌丝体,但无法确定真菌种属。27例标本PAS染色后诊断可疑真菌感染27例,PAS染色菌丝呈品红色,有些菌丝内见横隔,可见45。分枝,呈珊瑚状排列,部分菌丝较为粗大,形态学上无法鉴别为曲霉或毛霉。2.FISH阳性对照结果显示茵丝壁及菌丝内杂交信号呈绿色的颗粒状,杂交信号较强图A。27例可疑真菌感染标本14例杂交结果为阳性,组织内信号同阳性对照组,为绿色颗粒状,呈局灶性或散在分布,信号较强,比较容易判断,易与背景区分,可以确定为曲霉菌图B;13例结果为阴性,未见杂交信号。12例阴性对照和2例不含探针的空白对照均未检出荧光信号图C、D。讨论IFI的诊断主要依据临床观察、影像学和实验室检查。其临床表现缺乏特异性,可为发热、呼吸道症状如咳嗽、咳痰、咯血、呼吸困难等、组织坏死性损伤或穿孔等,与其他病原菌感染不易区分,且症状易被原发疾病掩盖,早期诊断困难。影像学表现呈多样性,肺部CT少有“光晕征”、“新月形空气征”,实变区域内仅可出现空腔等非特异性征象,其他部位的真菌感染更难以采用CT鉴别,容易误诊。临床上实验室检查多采用传统的直接镜检和培养法,但仅在无菌体液中检出真菌IFI才具有诊断意义。因此,开放部位的样本需要多次检测并结合临床才能诊断。而培养的周期长。一般为23周或更长,阳性率极低,易漏诊,延误治疗。上述方法由于依从性差、周期长,达不到早期诊断、早期治疗的目的。血清学检查主要是抗原检测,包括GMGALACTOMANNAN检测和BDG1,3BETADGLUCAN检测,虽可早期诊断真菌感染,但其结果受阳性界值的影响,国内对其阳性界值的划定尚待研究,又易因患者饮食及使用的药物而产生假阳性或假阴性结果,干扰因素较多,临床尚未推广应用,且无法判断菌种嘲。传统组织病理学检查仅依据形万方数据第4期孟浦等.FISH检测快速诊断曲霉菌感染的临床价值333态学观察真菌,若真菌形态不典型则无法鉴别。HE染色的标本中真菌不易着色,PAS染色虽然能够较好的显示真菌形态,如曲霉菌典型表现为菌丝内见横隔,粗细均匀,为45。分枝,呈珊瑚状排列,但多数菌体缺乏特异性,无法区分曲霉与毛霉,不能鉴定曲霉菌的不同菌种,若菌体发生退变坏死,则更难以鉴别。曲霉菌特征性的分生孢子梗在实体的组织病变中很难看到,本研究中的27例病例HE染色诊断可疑真菌感染23例,PAS染色后诊断可疑真菌感染27例,说明仅以形态学诊断或鉴别曲霉菌与其他真菌感染都有较大局限性。IFI的治疗分为预防治疗、经验治疗、抢先治疗和确诊治疗,近年来国际上越来越重视抢先治疗。近日一项研究表明,对于粒细胞减少的恶性血液病患者,当出现持续发热时,抢先抗真菌治疗能达到与经验治疗相似的生存率,但前者能降低治疗的费用L6J。而抢先治疗的基础就是早期诊断,因此需要新的方法快速检测病原菌,以为临床提供循证学依据。而不同的真菌菌种对抗真菌药物的敏感性不同,因此,甄别IFI的不同菌种对合理选用抗真菌药物有重要意义。图A.阳性对照显示菌丝壁及菌丝内杂交信号呈绿色颗粒状1000;B.实验组阳性结果的杂交信号呈绿色颗粒状1000;C、D阴性对照和空白对照未见荧光信号X1000FIGA.THEPOSITIVECONTROLSHOWINGGREENGRANULARHYBRIDZATIONSIGNALDISTRIBUTEDINTHEHYPHAEANDHYPHAEWALLS.1000;B.THEPOSITIVERESULTSOFEXPERIMENTALHYBRIDIZATIONSIGNALISGREENGRANULAR.1000;C、D.NEGATIVECONTROLAND’BLANKCONTROLSHOWINGNOFLUORESCENCESIGNAL.1000组织病理学检查仅属于形态学诊断,其敏感性和特异性亟待提高,改进措施之一就是结合分子生物学技术,原位杂交技术为检测组织中的真菌提供了快速、敏感的方法。FISH技术能快速检出致病菌,具有高敏感性和特异性。国内外已有报道利用FISH成功检测细菌、真菌等病原菌,其中检测真菌的报道较少,且多选取液体标本如血液、分泌物等。WILSON等‘73用FISH检测244份阳性血培养瓶中的革兰染色阳性念珠菌,KEMPF等嗍对115份血液标本进行FISH,快速检测出白色念珠菌。万方数据334中国组织化学与细胞化学杂志第19卷FISH技术用于检测病原菌具有检测信号强及特异性高等优点。且该技术不同于其他方法之处在于是在完整的细胞内检测菌体,易于避免污染引起的假阳性结果,即使为开放部位的标本也不需要多次检测,而FISH用于检测石蜡切片中的曲霉菌尚无报道。本研究使用的探针由国外学者设计,是针对曲霉菌18SRRNA的特异性寡核苷酸探针,以18SRDNA为靶序列。依据文献,该探针序列与烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、土曲霉及灰绿曲霉等有90%一100%的同源性。寡核苷酸探针无需变性,能避免出现双链DNA探针复性的问题,杂交体稳定,杂交速度快,效率高,特异性强,假阳性率少,且制备简便快速,价格低廉。这些特性使得用FISH技术来检测曲霉菌,以排除念珠菌等其他真菌感染具有更突出的优势。本实验将FISH用于临床标本的检测,对27例病理组织石蜡切片进行分析,并与HE及PAS染色结果对比。为识别组织中的阳性杂交信号,试验设置空白对照,即用不含探针的杂交液与组织切片反应,然后用抗体检测。实验组27例标本经FISH检测结果14例为阳性,13例结果为阴性。阳性对照检出杂交信号强,证明FISH结果具有特异性。阴性对照和空白对照均未见杂交信号,说明探针无非特异性结合。27例标本经HE和PAS染色均考虑为真菌感染,HE和PAS染色虽能对大部分真菌显色,但只能从形态学上观察真菌,没有特异性,不能鉴别出是那种真菌感染。而FISH所用的是针对曲霉菌的特异性探针,能敏感的鉴定出曲霉菌。FISH检测不但进一步证实了HE和PAS染色的真菌为曲霉菌,而且还提示FISH检测13例阴性患者可能为其他真菌种属。FISH可检测石蜡组织标本中的曲霉菌,在进一步的研究中有望推广于临床,用以检测分泌物、血液及组织切片等各种类型的临床标本,此外,还可根据不同种属的曲霉菌设计出靶DNA序列特异性探针,明确曲霉菌种,以期早期病原学诊断IFI,达到抢先治疗的目的,合理选用抗真菌药物。参考文献13PAUWBD,WALSHTJ,DONNELLYJP。ETA1.REVISEDDEFTNITIONSOFINVASIVEFUNGALDISEASEFROMTHEEUROPEANORGANIZATIONFORRESEARCHANDTREATMENTOFCANCER/INVASIVEFUNGALINFECTIONSCOOPERATIVEGROUPANDTHENATIONALINSTITUTEOFALLERGYANDINFECTIOUSDISEASESMYCOSESSTUDYGROUPEORTC/MSGCONSENSUSGROUP.CLININFECTDIS,2008,4612181318212MENZINJ,MEYERSJL,FRIEDMANM,ETA1.MORTALITY,LENGTHOFHOSPITALIZATION,ANDCOSTSASSOCIATEDWITHINVASIVEFUNGALINFECTIONSINHIGHRISKPATIENTS.AMJHEALTHSYSTPHARM,2009,66191711171733PARKC,KIMJ,ANDT.MONTONEK.DETECTIONOFASPERGILLUSRIBOSOMALRNAUSINGBIOTINYLATEDOLIGONUCLEOTIDEPROBES.DIAGNMOLPATHOL,1997。652552604周东风,刘树茂,费洪宝。等.细胞原位杂交技术在先天愚型诊断上的应用.中华医学遗传学杂志,1996,131515253BARNESRA.EARLYDIAGNOSISOFFUNGALINFECTIONINIMMUNOCOMPROMISEDPATIENTS.JANTIMICROBCHEMOTHER,2008,611I3I663CORDONNIERC,PAUTASC,MAURYS,ETA1.EMPIRICALVERSUSPREEMPTIVEANTIFUNGALTHERAPYFORHIGHRISK,FEBRILE,NEUTROPENICPATIENTSARANDOMIZED,CONTROLLEDTRIAL.CLININFECTDIS,2009,4881042105L7WILSONDA。JOYCEMJ.HALLLS,ETA1.MULTICENTEREVALUATIONOFACANDIDAALBICANSPEPTIDENUCLEICACIDFLUORESCENTINSITUHYBRIDIZATIONPROBEFORCHARACTERIZATIONOFYEASTISOLATESFROMBLOODCULTURES.JCLINMICROBIOL,2005,4362909291283KEMPFVAJ,TREBESIUSK,AUTENRIETHIB.FLUORESCENTINSITUHYBRIDIZATIONALLOWSRAPIDIDENTIFICATIONOFMICROORGANISMSINBLOODCULTURES.JCLINMICROBIOL,2000。382830838万方数据

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