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Sorafenib 联合紫杉醇不同给药顺序作用于人肝癌细胞BEL-7402 的效应.pdf

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Sorafenib 联合紫杉醇不同给药顺序作用于人肝癌细胞BEL-7402 的效应.pdf

癌症’,/01120333435364基础研究大连医科大学附属第二医院肿瘤科辽宁大连778109’,/012,3455637856656935,65;85/656565ABCDEDF156通讯作者张阳;/,A38B677B36897027B8804CD38B677B36E37899FG,HI;,JG;G,B/GB/收稿日期0113K70K17修回日期0112K16K12’’,/01’231’,/0120’,2,1345’5067887’97;5,27090,05852,/26’2’80’’8’0’56080’5,0’5608,0808’08AB/CDEF0’265,’27’1850’;415AB/GDEF80250’60800’’52’852,0’01960,0’,756080;55000’578’8’0’HIJE’’26827K;0’88780’20660’07L27877;M56’98/F’AB/GDEF800,27’;61,7DN55HIJO0’0’26080AB/GDEF80F;DPQE3PF1RB0’2S3NTQE3GF1RB68973U0’80,2887800650560808V280WFRK650X0’2WFRK650’220’2051506680PY3DPQF3FTZ’2,825’’19’68’86’551,6OXO\;M56’98/F05’AB/GDEF80250’06080;8’7,22’0’0’06080’2,8051506680’AB/GDEF850’02’0’,0’,756080;M56072,5052,108’2’88786500’256’8/F15’992;91;5608,0808’00’6080852,/26’2’8/F摘要背景与目的LM是一种多靶点的抗肿瘤药物其治疗原发性肝癌的疗效已经初步得到证实’本研究应用LM与紫杉醇/,D,NO联合观察两药不同的给药顺序作用于人肝癌细胞PQRK9610的不同效应初步探讨产生这种差异的机制’方法采用S法检测LM与紫杉醇单药作用于PQRK9610细胞的TE1’流式细胞术检测LM与紫杉醇不同给药顺序作用后PQRK9610细胞周期和凋亡率的变化’UM,检测不同给药顺序作用后的PQRK9610细胞P/,K0的表达情况’结果LM和紫杉醇单药作用于PQRK9610细胞63的TE1分别为0B64V1B40WGR7B32V1B90WGR’分析LM紫杉醇单药先用紫杉醇再加入LM先用LM再加入紫杉醇及紫杉醇与LM同时作用后PQRK9610细胞周期及凋亡率的变化结果显示LM主要将细胞阻滞在L期而紫杉醇主要将细胞阻滞在X0KS期’先用紫杉醇再给予LM组细胞L期及X0KS期均有延长且较其他组获得较高的凋亡率48B64V0B02YGZ1A17’UM,显示先用紫杉醇再给予LM组PQRK9610细胞的P/,K0表达的水平最低’结论LM联合紫杉醇不同给药顺序作用于PQRK9610细胞先应用紫杉醇诱导再序贯给予LM时细胞凋亡率更高12联合紫杉醇不同给药顺序作用于人肝癌细胞ABCD的效应李娜张阳吴涛李曼’51,711E1111’122’F22;25E’72G175,F51E’177,7’’2F’177721ABCH0B0’1_50’1M0‘,’2K’BCMYK原发性肝癌是中国常见的恶性肿瘤之一手术是目前原发性肝癌的基本治疗手段但是原发性肝癌发病隐匿大多数患者在确诊时已经无法接受根治性手术治疗即便接受手术切除治疗患者的年生存率也只有且手术完成后年内的肿瘤复发率高达多数复发者无法再次接受根治性手术因此药物治疗成为原发性肝癌治疗的重要手段之一然而原发性肝癌细胞对化疗的敏感度较低且晚期肝癌患者常伴肝硬化不健全的肝功能局限了化疗药物的应用随着对原发性肝癌细胞分子生物学的深入研究分子靶向治疗逐渐成为原发性肝癌治疗中的焦点’,是首个口服的小分子多靶点抗肿瘤药有抑制肿瘤细胞生长和抑制肿瘤血管形成的双重抗肿瘤作用/012试验是’,用于治疗原发性肝癌的期临床试验其结果在3年美国临床肿瘤协会045’年会公布’,使患者的中位总生存时间较对照组延长了67个月中位疾病进展时间延长了63个月8尽管小分子的靶向药物有一定的临床疗效但是该类药物对肿瘤仅起抑制而非杀灭作用单药的临床有效率仅9;9因此靶向药物与化疗联合是否能达到协同或相加的作用其联合作用的机制最佳效应及最适宜的方案需要在临床试验前进行系统的研究加以确定本研究旨在研究’,与紫杉醇联合不同给药顺序作用于人肝癌细胞3产生的不同效应初步探讨产生这种差异的机制为原发性肝癌的综合治疗提供基础理论依据材料与方法实验材料人肝癌细胞株3购自上海中国科学院细胞库由大连医科大学附属第二医院中心实验室传代保存12ABC购自/DEF’,公司标准新生牛血清购自杭州四季青生物公司胰蛋白酶购自GH公司实验药物’,由D公司合成紫杉醇购自太极集团四川太极制药有限公司草酸铂与伊立替康均购自江苏恒瑞医药股份公司奈达铂购自齐鲁制药有限公司鼠抗人EF单克隆抗体购自,I4JK公司实验方法66ALL检测紫杉醇草酸铂伊立替康奈达铂种药物及’,作用于3细胞株抑制率取对数生长期的细胞以最佳密度M个NH接种于;C孔板N孔设置8个复孔加入按一定比例稀释成不同浓度的药物各置于83O45饱和湿度的孵箱中继续培养实验中止前P每孔加入HGNH的ALL培养P再加入QA5N孔微振荡器上振荡溶解RH,以空白对照调零用自动酶标仪在3,H波长处测定每孔的吸光度’值细胞抑制率ST加药组值T空白对照组值’N正常对照组值T空白对照组值’U9计算B4以上实验重复8次将B4VGNH定义为高度敏感选用敏感的药物作为主要研究药物66流式细胞术检测不同给药顺序对3细胞株细胞周期及凋亡率的影响取对数生长期的3细胞以U个NH浓度分别接种于H的培养瓶中共C组空白组对照组’不加任何药物培养细胞7P紫杉醇L0W’组单独用紫杉醇67GNH’培养P’,组单独用’,678GNH’培养P先用紫杉醇后用’,L’组先用紫杉醇作用P然后加入’,继续作用P先用’,后用紫杉醇L’组先用’,作用P然后加入紫杉醇继续作用P同时用紫杉醇和’,LX’组同时用紫杉醇和’,作用P各处理组加入药物处理后用Y9胰酶消化细胞制成细胞悬液按流式细胞试剂盒说明书处理细胞流式细胞仪检测所得数据输入A04BZLB/C型计算机并用A’IY软件分析细胞周期分布实验重复8次YY8\I,F’I检测EF的表达水平实验分组同流式细胞术取EI,水平作为等量蛋白质上样对照取蛋白样品进行Q20凝胶电泳转移到硝酸纤维素上脱脂奶粉封闭O过夜加入稀释好的一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗Q0显色观察有清晰的特异性条带出现时用大量的水冲洗以终止显色反应统计学处理采用28Y软件包数据以均数_标准差产生这种不同效应的可能机制为两种药物作用于不同的细胞周期以及不同给药方法后的EF的表达水平不同关键词肝肿瘤N药理学’,索拉非尼’紫杉醇用药顺序EF中图分类号1383Y8文献标识码0文章编号TC3W;’7T787TC李娜等Y’,联合紫杉醇不同给药顺序作用于人肝癌细胞3的效应CMYK表不同浓度’作用,/012细胞不同时间后的细胞增殖抑制率345’6,’783’95’8,0;7’553’’’’,/01230145016789;414;12210210032;93A1551;4A102;12A212412;A210010A21710A412410A150;165A01;0516A015072124A162517A01;74614;A1;1A160710A21;6;2106A2156;12A12770147A2154214A01426240164A2164514A215166A0146615A174615A41470167A1677164A0156521;A0152012A01;’’BC表示细胞生长抑制率采用回归分析不同处理组间比较采用完全随机设计的方差分析显著性水平D090结果几种药物作用于’细胞的,紫杉醇草酸铂伊立替康及奈达铂作用于EFGH6I2细胞7的0分别为175A0162,JG014A12,JG2012A0172,JG241;;A15,JGKB’的0为214A0142,JG不同浓度不同时间KB’对EFGH602细胞的抑制作用如表所示KB’对EFGH602细胞有明显的抑制作用且这种抑制作用随着浓度的增加而增强有剂量依赖性在同一个浓度下随着作用时间的延长而增强有时间依赖性D51644L010/01234567和紫杉醇单独与不同顺序联合给药对’细胞周期和凋亡率的影响流式细胞术检测KB’和紫杉醇单独及不同顺序联合给药对EFGH602细胞细胞周期及凋亡率的影响如图和表2所示’紫杉醇主要使细胞阻滞在M2HN期而KB’主要使细胞阻滞在K期;组细胞中OK组凋亡率最高4;94P2125Q明显高于其他各组差异有统计学意义L090而KO组的凋亡率596A95Q明显低于OK组但与他各组比较差异无统计学意义R090李娜等9K’联合紫杉醇不同给药顺序作用于人肝癌细胞EFGH602的效应图K’和紫杉醇不同给药顺序对细胞周期及凋亡的影响S,TUUVUWXT’’WYYXXEFGH6I2UUXWVX’’WYUZUBU’’W’XWTUX’XB’\BX,’BYBUBZUKO’XB’\BX,’YBUBZUOK’XB’\BX,’XTUB’TXUV\YBUBZU1BLI1I81CMYK图’和紫杉醇不同给药顺序对,表达的影响/01’234’55,26789,’5’’;5’4,3’’,;’’5,’;1’514ABC’AAAD9EFG79HIJKHJL9H7KHJ98HKJH778HJ7KHI7MHI9KFHNHLKH7FGFNHJIKFH8NJ9H7MKH79I9H8NK8HJIIHLKFHLILJHN8KJH8L8MH9KJHFIOPGF9H9FK9HNM8LHMJK9H7IFMHNK9HNLJFHJMK8HMF9H8IKH7MHMK9HM9B4455GFHJ7K9HMJFFH8JKFHMF9HILKFHMJIH8JKHNNH78KFHMNF7H89K9HM8’,和紫杉醇单独与不同顺序联合作用后/0123细胞450表达水平的改变Q’5’结果如图所示’单药组,表达较阴性对照组下降R9H9MA组中,表达较AAS均下降R9H9M其他各组的差异无统计学意义T9H9M讨论全身的化疗是晚期肝癌治疗的重要手段之一目前临床上常用于原发性肝癌治疗的药物包括阿霉素顺铂丝裂霉素M/U及近年来出现的新药如伊立替康吉西他滨等除此之外奥沙利铂及紫杉醇应用于肝癌治疗的临床前研究也逐年增多本实验药物敏感性的筛选发现26789细胞对紫杉醇和奥沙利铂相对敏感提示这两种药物可能成为肝癌治疗的新选择尽管有这些化疗药物可以用于原发性肝癌的治疗但目前尚没有足够的循证医学证据证明某一种药物能够使肝癌患者获益随着VBWX试验的结果在997年BY年会上公布’被认为开创了肝癌治疗的新时代然而靶向药物只能抑制而非杀灭肿瘤细胞与传统的化疗药物联合可能会进一步提高抗瘤效应但是这两种方法的联合是否仅仅是简单的相加效应还是存在最佳效应最适宜的方案仍然需要更加深入的研究目前靶向药物与化疗药物的联合研究较多的是2/WAZ类的药物例如PM’55和Y778等研究提示2/W高表达的肿瘤对化疗相对敏感而肿瘤对化疗的抗药与其生长信号的降低有关’M\L如果靶向治疗同时或先于化疗给予就可能降低化疗的效果相反如果先期给予多周期化疗的诱导则可能进一步提高2/W的表达水平使后续靶向药物的靶向性更强’NF9两个大型的多中心的’55同时联合卡铂O紫杉醇和顺铂O吉西他滨做为不能手术的期的非小细胞肺癌一线方案的期临床试验显示两种药物的联合并未使患者获益’FFF因此靶向治疗和化疗药物的联合并不是简单的相加军事医学科学院J97医院与意大利国立癌症研究院的研究人员从分子药理学的角度对’55与不同化疗药物联合的机制进行了探讨首次提出’55与化疗药物的联合效应存在最佳给药方案和时机的理论’FJ认为’55与化疗联合的最佳模式应该是化疗诱导起效后停止化疗序贯持续给予’55’与化疗药物的联合是否也如2/WAZ类的药物一样存在最佳给药方案和给药顺序国内及国外的文献尚未见报道本实验通过流式细胞术检测’联合紫杉醇对26789细胞细胞周期及凋亡的影响发现不同的给药顺序产生了不同的效应先加’组的细胞凋亡率仅与紫杉醇单药的凋亡率相仿虽然’与紫杉醇同时作用组的凋亡率高于紫杉醇单独作用组但是后加’组能获得更高的凋亡率由此提示’和化疗药物的联合作用可能与2/WAZ类药物一样存在最佳的给药时机和给药顺序先给予化疗诱导再加用’可能是更好的选择在细胞周期的分析中发现’可使26789细胞的F期缩短而期延长这与61等’F8用’处理V’4细胞的结果相似说明’主要将26789细胞阻滞在期使大部分细胞不能进入细胞周期的下一个时段从而抑制细胞增殖并诱导其凋亡而紫杉醇是一种细胞周期特异性药物主要抑制微管网的正常重组可使细胞停滞在P期’FM本实验也提示紫杉醇单独作用于26789细胞使其P期显著延长抑李娜等H’联合紫杉醇不同给药顺序作用于人肝癌细胞26789的效应表’和紫杉醇作用,/012细胞的细胞周期及凋亡率3456’78’66996’;3;33,079’663’’;3’;96A’66’;;’’39B’;6’3CMYK制其增殖并诱导凋亡在紫杉醇和’不同给药顺序的联合处理组发现各组的,期均不同程度的缩短在后加’组/,0期延长1期变化不明显凋亡率显著增加先加1’组1期显著的延长23456734628’而/,0期变化不明显凋亡率显著低于后加1’组同时加入两药组1期和/,0期均有延长凋亡率介于其他两组之间此结果提示先加入1’组的凋亡率较另外两组明显降低可能与1’和紫杉醇作用于不同的细胞周期有关1’先于紫杉醇作用于细胞使细胞大部分阻滞在1期无法正常进入/,0期使细胞对周期特异性药物紫杉醇的敏感性减低导致凋亡率的下降因此先用紫杉醇诱导再序贯应用1’可能为最佳选择19;等’和9等’的研究提示在一些细胞株中紫杉醇能够提高A的活性如果阻断0ABA的通路紫杉醇诱导的细胞凋亡受阻CD’等2’将紫杉醇作用于肝癌细胞它抑制肝癌细胞的增殖并将其阻滞在/,0期且这种作用可能是通过A通路实现的A通路的阻断导致紫杉醇诱导的细胞凋亡和细胞周期阻滞作用被消减同样AE等5’也发现,的活性能诱导细胞的/,0期阻滞提示其在细胞有丝分裂阶段具有重要的作用而且还发现紫杉醇介导的细胞凋亡可能存在两种机制紫杉醇的浓度F5’EB时其诱导的凋亡作用与,活性无关/紫杉醇浓度5’EB时其诱导的凋亡作用通过,通路实现本实验中紫杉醇的浓度为53’EB42GB提示紫杉醇诱导H,6/细胞凋亡的机制可能与,通路相关而1’先于紫杉醇给予阻断了IJB0ABA通路导致紫杉醇的敏感性降低这其中的具体机制还需要在下一步的实验中明确与其相反在CD’等/’的研究中发现在食管癌细胞中0ABA通路与紫杉醇的细胞毒性并无关联这可能与相同的药物及相同的细胞信号转导通路在不同的细胞可以有不同的作用方式和作用机制有关需要在相关的实验中明确HKE,/基因是重要的凋亡抑制基因HKE,/基因及其表达蛋白可以抑制多种组织细胞凋亡延长细胞寿命被人称为存活基因它主要通过自身二聚或与HL等蛋白形成异二聚体来发挥其调控细胞凋亡的功能且有研究表明/’HKE,/磷酸化和细胞周期中/B0期的细胞积聚相关能使0期向B期的转换延迟用微管损害剂紫杉类处理细胞在/B0期捕获的细胞中也发生HKE,/的磷酸化//’HEEKD等/3’及0M等/6’的研究显示IJB0ABA信号转导通路在肝癌细胞中与HKE,/的表达呈相关性HKE,/的NI水平在,有活性的细胞中表达高提示IJB0ABA信号转导通路调控HKE,/的表达而且这种调控作用可能与A介导KI0O应答元件结合蛋白表达相关1’可通过阻断IJB0ABA信号转导通路而下调HKE,/的表达在本实验中通过PQR’ER分析可见1’能下调H,6/细胞中HKE,/的表达这可能是1’诱导H,6/细胞凋亡的机制之一在不同给药顺序的三组细胞中HKE,/表达在后给予1’组明显降低而其他两组的表达未见明显的差别提示先加紫杉醇后加1’能明显降低HKE,/的表达从而促进细胞凋亡其中的机制还需在下一步的实验中进一步明确综上所述本课题通过0SS,流式细胞术和PQR’印迹几种方法研究了单独应用1’及1’联合紫杉醇对人肝癌细胞株H,6/的作用发现1’能够诱导H,6/凋亡在联合紫杉醇共同作用时先给予紫杉醇诱导再加入1’能够获得较高的凋亡率因此提示在原发性肝癌的临床的综合治疗中化疗药物诱导后再序贯给予靶向药物可能获得更佳的抗肿瘤作用化疗药物与靶向药物的联合是未来临床应用的方向之一应根据不同靶向药物和化疗药物的作用特点进行严谨的临床前研究为临床工作提供理论依据参考文献HQK;JTQUVW0RE4OMEXK’KYEZYZ’KZ’K’ZR’ZQU’4QR’REGM/6/19\\E114SD’DAAY;NRARE4Q9ERQ/2EXQKR’Q;\RKEE9EKK’U’4IK;19G5534EXUKK10WW_RE41’\XQQ9XXE’ZX’KZ;\RKEE9EKK’‘AAQ9ERQ\;Q’ZWZ\EK,K’REEZRE1‘IOREU’4U9’EAE’KEC’KEGM//HI4PE;E1A;’V14HI63,5\KE’KEZRU’4A9O;VQ//2/////4’/’3’6’李娜等41’联合紫杉醇不同给药顺序作用于人肝癌细胞H,6/的效应CMYK’,/01’234’5657’5’8’958;1;5’95A44’B/4’574C44D’9E5’’4FG34EFG7’H2I7DJKKLJKJK’JMKMNJMLK2/59’AOP4179379’0’52Q954R;RR’58PSTUVWXKKM755’5657’5C64’5’45A5’’357’’A’9C5479’85’’4’9’54’5’755Y2Y358F75Z7DAJKKUJJLU’\K2/59’A_‘YE394‘’52A954B’58PSTUVWXKKM75’’9755’F5657’5CAY2A7SC7FZ7JKKVJJ’JD\U2F56EP57‘F55G’52S’’357’’A84G3’5’5’’’9’’75565’W65D’9857’7’755’6AFJJ\Y2FF57‘4LXXX\U’XKXNXLM2H649YE5I265D’9857’7’85A567944’J5’H2HK5’F57B4’LXXDX\’VULNVUV2D‘H4HSEF’52957’863D44’’A89355D574A65D’9857’H2PHF57LXX\J’ML\NMLX2/335HT5CB577B’52H3’W4’’3’556J6954BB’58D8’834A’5’65’’4’956576W45W73D757H2HFZ7JKKVJLLJ’JJVNJJUM2B577BE4’‘CH5D6F’52B8’75’’9D7’556745’56576W45W73D757’5954’5WBKSFLH2HFZ7JKKUJJD’NDU2徐建明宋三泰2表皮生长因子受体酪氨酸激酶靶向药物与化疗联合应用的合理设计H2中华肿瘤杂志JKKUJMM’VJLNVJV2_3_F5TF9F2C5874’9‘S/;H;‘5’95A9’4’35DD44566374’375’4495’73575756A_F;A‘/;\H2F57‘4JKKMMMJU’LLD\LNLLD\D2ECE42P57’55D442B’E4H569ASC5DAA’5L2CC35A5436F4544H2KT’H5B5ELXXK’\UN\MK2C355559E5’HFK’_’52H7’33’8D5D’44’35’’9’547’87A7CAD54WJH2HPF9JKKKJ\JK’LUDVDNLUDU\2_3FE_3FFT3E’52‘8’D57’5’6’54’5CW63765’4493537LXV74H2FB’9F88LXXDXX’MNM2Z5HK5D595529D’99’875774A57’5C56’9’8C’57354D5WD35’654565’44H2Z7‘JKKL\’LLX\NLJKK254C345P56E’J2H7954485CW6376FF5’9SF7’5’F6’H2F57‘4579LXXD\DLM’VMJKNVMJM2Z5H‘34’DS2A57’5CB6374AD6S7’5’8’9‘54;H;‘A5’95AB66’A8S7’5’D’9AD56FF5’9H579AH29H358PD75F94’AJKKLJMJJ’LX\\\NLX\MU2/3355TB54C379H’52A949A5’8P7WJ’AFFL5463DBJ;H954456’477A7D35’H2HPF9JKKKJ\JD’JLMMLNJLMM2T55’B79ME4ACH2PF_WJ4949A5’65657’5’6A5SCL;H3KW’5’545’95A557’5’65’BJ;HH2HFPLXXXLXLJ’DUMXNDUD2P57N0HAAN,95DE’52,6887’4855’HOL57’’A56P,_WJC44D’97A’667A893556395’’774H2_35JKKKLUMK’LKDKNLKXM2HAANP57N_EAAO’52CADA’‘5856P,_J5D5’D’97A’667A895’’774H2_35JKKKLUM’LKMKNLKX2编辑甘可建校对杨允贵\MDXLKLLLJLVLU李娜等2C58联合紫杉醇不同给药顺序作用于人肝癌细胞PO_WUKJ的效应L\LMLLDLXJKJLJJJVJUCMYK

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