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氨苄西林与双黄连注射液单用及配伍时对大鼠CYP2D6 的影响.pdf

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氨苄西林与双黄连注射液单用及配伍时对大鼠CYP2D6 的影响.pdf

书书书药物研究氨苄西林与双黄连注射液单用及配伍时对大鼠CYP2D6的影响王欢,吴东媛,杜智敏(哈尔滨医科大学附属第二医院药学部药物研究所、黑龙江省高校重点实验室,150081)[摘要]目的通过氨苄西林和双黄连注射液的大鼠体内、外实验,观察两种药物分别给药及合用时对大鼠CYP2D6的影响。方法对照组和实验组大鼠分别经尾静脉注射给予0.9%氯化钠溶液、双黄连注射液、氨苄西林、双黄连注射液联合氨苄西林,均给药1周。高效液相色谱法测定大鼠尿样及肝微粒体中CYP2D6探针药物右美沙芬的代谢率,观察氨苄西林、双黄连注射液分别单用及合用时对大鼠CYP2D6活性的影响。通过WESTERNBLOT法测定其对大鼠肝微粒体CYP2D6蛋白表达的调控。结果实验组大鼠分别给予双黄连注射液、氨苄西林及双黄连注射液配伍氨苄西林时,尿样中右美沙芬代谢率与对照组差异无显著性(P>0.05);实验组大鼠肝微粒体中加入右美沙芬(0.324MMOLL1),右美沙芬代谢率与对照组差异无显著性(P>0.05);各实验组与对照组CYP2D6蛋白表达差异无显著性。结论双黄连注射液、氨苄西林单用和两药配伍使用均不影响CYP2D6酶的活性,与同时使用经CYP2D6代谢的其他药物不会产生相互作用。[关键词]氨苄西林;双黄连注射液;CYP2D6;肝微粒体[中图分类号]R969.2;R977.3[文献标识码]A[文章编号]10040781(2008)05049104EFFECTSONCYP2D6BYTHESINGLEUSEOFAMPICILLINANDSHUANGHUANGLIANORCOMBINATIONOFBOTHG21WANGHUAN,WUDONGYUAN,DUZHIMIN(INSTITUTEOFCLINICALPHARMACY,DEPARTMENTOFPHARMACY,THESECONDAFFILIATEDHOSPITALOFHARBINMEDICALUNIVERSITY,HARBIN150081,CHINA)ABSTRACTOBJECTIVETOCOMPARETHEINFLUENCEOFSHUANGHUANGLIAN,AMPICILLINANDCOMPATIBILITYOFBOTHONTHEACTIVITYOFCYP2D6FROMTHERATLIVERINVIVOANDINVITRO,RESPECTIVELY.METHODSMICEINBOTHCONTROLANDTESTEDGROUPSWEREI.V.0.9%NACL,SHUANGHUANGLIAN,AMPICILLINANDCOMPATIBILITYOFBOTHFORONEWEEK;HIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHY(HPLC)WASUSEDTOMEASURETHEMETABOLISMRATEOFDEXTROMETHORPHAN(DM)INRATURINEANDLIVERMICROSOMALRECONSTITUTEDSYSTEMWHICHWASUSEDASAPROBETODETERMINETHEACTIVITYOFCYP2D6;FINALLY,THEEXPRESSIONOFCYP2D6FROMMICROSOMESWASEXAMINEDBYWESTERNBLOT.RESULTSNOSIGNIFICANTDIFFERENCESOFTHEMETABOLICRATEOFDMINURINE,INMICROSOMESANDCYP2D6EXPRESSIONWEREFOUNDINBOTHTHETESTEDGROUPSANDCONTROLGROUP.CONCLUSIONSHUANGHUANGLIANANDAMPICILLINHAVENOINHIBITORYEFFECTONTHEACTIVITYOFCYP2D6,SOTHATWHICHCOULDN'TPRODUCETHEDRUGSINTERACTIONWITHTHOSEMETABOLIZEDBYCYP2D6.KEYWORDSAMPICILLIN;SHUANGHUANLIANINJECTION;CYP2D6;LIVERMICROSOME细胞色素P4502D6(CYTOCHROMESP4502D6,CYP2D6)为肝脏中重要的Ⅰ相代谢酶,参与多种重要药物代谢[1]。许多药物治疗浓度范围窄,低浓度时疗效不佳,而较高浓度时出现毒性作用,因而确定某种药物是否影响该亚型酶代谢具有非常重要的临床意义。氨苄[收稿日期]20070912[基金项目]国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(基金编号2002AA2Z3410)[作者简介]王欢(1981-),女,黑龙江牡丹江人,在读硕士,主要研究方向药物代谢与临床药学。电话0451-88261079,EMAILWANGHUAN@YEAH.NET。[通讯作者]杜智敏(1956-),女,博士,教授,博士生导师,主要从事心血管药物与药动学研究。EMAILDUZHIMIN1956@126.COM。西林属广谱抗菌药,而双黄连注射液也具有抗病毒及抗菌作用。据文献报道,双黄连注射液联合氨苄西林静脉滴注时其抗菌和抗病毒作用加强,两药配伍较两药单用疗效更好[2]。笔者在本实验中通过高效液相色谱法(HPLC)测定双黄连注射液、氨苄西林及两药配伍时对大鼠尿液和肝微粒体重组系统中CYP2D6探针药物右美沙芬(DEXTROMETHORPHAN,DM)及代谢物去甲右美沙芬(DEXTROPHAN,DX)浓度的影响,探讨两种药物单用与配伍时对肝微粒体CYP2D6亚型酶活性的影响。1实验材料1.1动物雄性WISTAR大鼠,体重(20020)G,由哈尔滨医科大学动物中心提供,批号051012。1.2试药DM,批号051027;DX,批号051123;Β194医药导报2008年5月第27卷第5期葡萄糖醛酸酶(批号051108);己烷磺酸钠(批号050923)购于SIGMA公司。内标丁丙诺啡(BUPRENORPHINE,DB),批号051209,购于中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈为色谱纯。正丁醇、正己烷、磷酸二氢钾、氢氧化钠为国产分析纯。双黄连注射液购于哈尔滨医科大学附属第二医院门诊,哈药集团三精制药有限公司生产,批号05071413。氨苄西林购于哈尔滨医科大学附属第二医院门诊,哈药集团制药六厂生产,批号06020812。CYP2D6一抗,批号G0612(兔抗人)购自DAIICHIPURE公司,二抗,批号H0703(山羊抗兔)购自SANTACRUZ公司。1.3仪器WATERS2010色谱管理系统(717自动进样器,616泵,470荧光检测器);高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司),HYPERSILC6H5柱(4.6MM250MM,5ΜM,大连依利特公司),SHAC型水浴恒温振荡器(江苏金坛市亿通电子有限公司)。2方法2.1动物模型的制作将大鼠随机分成4组对照组、双黄连组、氨苄西林组及双黄连氨苄西林配伍组,每组8只,4组大鼠分别自尾静脉注射给予0.9%氯化钠溶液0.24MLD1,双黄连注射液0.24MLD1,氨苄西林0.05GD1(溶于0.9%氯化钠溶液0.24ML)、双黄连0.24ML+氨苄西林0.05GD1连续诱导1周,第8天时4组大鼠均灌胃给予6MGKG1DM,并留置代谢笼收集8H尿液后,大鼠断头处死(处死前禁食24H)。取尿样和肝脏,分别置于-20℃和-80℃冰箱保存备用。2.2尿样处理取1.0ML尿样,加入Β葡萄糖醛酸酶2800U和DB溶液2MMOLL150ΜL,PH值5.0醋酸钠缓冲液1ML,混旋0.5MIN,置于37℃水浴水解14H后加入提取液3ML[正己烷正丁醇(91,VV)]及3MOLL1氢氧化钠1ML,混旋5MIN,3000G离心5MIN,取出上层有机相2ML置于具塞离心管中,加入0.01MOLL1盐酸200ΜL混旋3MIN,3000G离心5MIN,小心取下层水相,20ΜL进样分析[3]。2.3肝微粒体的制备肝组织经剪碎、漂洗、吸干后称重,按14(VV)加入PH值为7.4匀浆缓冲液(内含50MMOLL1TRIS,11.5GL1氯化钾),冰浴,用玻璃匀浆器制成肝匀浆,4℃9000G离心20MIN,取上清液4℃100000G离心60MIN,取沉淀重悬于0.25MOLL1蔗糖溶液中,分装,置于-80℃冰箱内保存,用BRANFORD方法测定肝微粒体的蛋白浓度。2.4肝微粒体体外温育系统及样品处理温孵反应体系中包括肝微粒体蛋白浓度为1MGL1,NADP+1MOLL1,异柠檬酸钠200MMOLL1,异柠檬酸脱氢酶10UML1,氯化镁10MMOLL1,探针药物DM0.3MMOLL1,以0.1MOLL1的磷酸盐缓冲液(PH值=7.4)定容至500ΜL,反应前加入NADP+。该混合物在37℃水浴中温育40MIN后加入50ΜL冰冷的三氯醋酸终止反应。反应液中加入50ΜLDB(2MMOLL1),3MOLL1氢氧化钠100ΜL,2ML正己烷正丁醇(91,VV),混悬振荡5MIN提取,3000G离心5MIN,取上层有机相2ML置于具塞离心管中,加入0.01MOLL1盐酸150ΜL混旋3MIN,3000G离心5MIN,取下层水相20ΜL进样分析[3]。2.5测定探针药DM与代谢物DX的色谱条件WATERS2010色谱管理系统(717自动进样器,616泵,470荧光检测器);流动相0.01MOLL1磷酸二氢钾0.01MOLL1己烷磺酸钠乙腈甲醇(333310094,VVVV),PH值=4.0,流速1.0MLMIN1,色谱柱HYPERSILC6H5柱(4.6MM250MM,5ΜM,大连依利特公司),室温下测定,EX=280NM,EM=310NM。尿样及肝微粒体温育系统中的DM和DX均采用以该色谱条件测定。2.6CYP2D6的蛋白表达取各组大鼠肝微粒体,用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电转移至硝酸纤维素膜上。室温下在封闭液(含3%脱脂奶粉的TBST)中封闭1.5H,加入CYP2D6的抗体(11000稀释)温育2H,用TBST冲洗4次(每次5MIN),加入二抗(14000稀释)孵育1H,TBST冲洗4次,化学发光法发光显迹,X线胶片显影,凝胶的X线照片用光密度分析仪对免疫特异性条带进行扫描分析。2.7统计学方法体内尿样本中得出各实验组和对照组DM的代谢率和相应体外肝微粒体重组实验中得出的数据做统计分析。实验结果均以XS表示,比较各组间差异,用单因素方差分析检验。3结果3.1体内实验中双黄连注射液、氨苄西林及两药配伍时对CYP2D6活性的影响3.1.1尿样品色谱图在“2.5“项所述DM和DX测定的色谱条件下,标准品中DM、DX和DB三者分离良好(见图1A),空白尿样中未出现DM和DX峰(图1B),并且DM和DX与尿液中的干扰成分可较好的分离,与内标DB也分离良好(图3C),其保留时间(TR)分别为TR(DX)=5.9MIN,TR(DB)=7.6MIN,TR(DM)=8.3MIN。尿样色谱图见图1。3.1.2体内氨苄西林、双黄连及其配伍时对CYP2D6294HERALDOFMEDICINEVOL27NO5MAY2008活性的影响称量每只大鼠的肝脏重量及体重,相对肝脏重(GKG1)=大鼠肝脏重量/体重[4]。各组间大鼠相对肝脏重差异无显著性,说明氨苄西林、双黄连及其配伍时对大鼠相对肝脏重没有影响,结果见表1。用HPLC法测定大鼠尿液中DX与DM的浓度比,DM的代谢率(%)=DX/DM100%。各组代谢率差异无显著性(F=2.57,P>0.05),说明氨苄西林、双黄连注射液及其配伍时对大鼠CYP2D6的活性没有影响,结果见表1。图13种尿样的高效液相色谱图1.DX;2.DB;3.DM表14组大鼠尿液中DM代谢率及相对肝重测定结果XS组别剂量大鼠尿液中DM代谢率肝重大鼠重/(GKG-1)双黄连注射液组0.24MLD-18.544.9029.54.6氨苄西林组0.05GD-17.451.2030.83.5两药配伍组0.24MLD-1+0.05GD-19.323.6030.15.1对照组0.24MLD-110.701.7028.94.33.2体外实验中双黄连注射液、氨苄西林及两药配伍时对大鼠肝微粒体CYP2D6酶活性的影响3.2.1肝微粒体体外重组系统色谱图在“2.5”所述测定DM和DX的色谱条件下,标准品中DX、DB、DM及干扰峰分离良好。图2为空白肝微粒体体外重组系统中加入探针药DM及DX标准品所得到的高效液相色谱图。图2肝微粒体体外重组系统色谱图1.DX;2.DB;3.DM3.2.2体外实验CYP2D6活性的变化HPLC法测定肝微粒体重组系统中DM及其代谢物DX浓度,DM代谢率=DX/DM100%,观察探针药物DM代谢率变化情况。结果显示实验组和对照组DM代谢率差异无显著性(F=1.76,P>0.05),结果见图3。图34组DM代谢率3.3双黄连注射液、氨苄西林及其合用对大鼠CYP2D6蛋白表达的影响4组大鼠肝微粒体对CYP2D6蛋白表达的结果见图4。其他各组肝微粒体对CYP2D6蛋白表达略高于对照组,但各组间的表达均差异无显著性。图44组大鼠肝微粒体CYP2D6蛋白表达测定结果4讨论药物相互作用是产生药物不良反应的重要原因。其中药物代谢性相互作用占其发生率的40%[5]。肝微粒体酶的细胞色素P450是肝微粒体混合功能氧化酶中最重要的一族,在外源性物质和内源性物质的代谢中起着极其重要的作用[6],机体>90%的药物代谢都要通过P450,其中CYP2D6含量占P450肝脏蛋白总量的1%~2%,虽然含量不高,但参与代谢的药物却占总P450代谢药物的30%[7]。CYP2D6的底物均为其竞争性抑制药,其中有研究报道较强的抑制药有20余种,这些药物可抑制CYP2D6的活性,使抗心律失常药、Β受体阻滞药、抗高血压药、抗抑郁药以及抗精神病药中经CYP2D6代谢的药物消除减慢,血药浓度升高,不良反应发生率升高,甚至出现不良反应[1]。氨苄西林与双黄连注射液均为临床常用的抗菌药物,且双黄连与氨苄西林钠配伍较两药单用疗效更好[7]。但二者对CYP亚型的影响笔者还未见报道。明确氨苄西林与双黄连注射液对CYP2D6的影响正是本研究的宗旨所在。本研究中用氨苄西林、双黄连及两药配伍作为受试394医药导报2008年5月第27卷第5期药物,动物实验中探针药物选用DM,测定DM代谢率,反映大鼠CYP2D6的活性。为作出全面判断,本实验从体内、体外及蛋白表达三个角度来测定CYP2D6酶的活性。本实验还简化了色谱条件,使尿样与肝微粒体中样本的测定都在同一配比的流动相下完成。体内、外实验结果一致,表明氨苄西林、双黄连及其配伍时对大鼠2D6亚型均没有抑制或诱导作用。但氨苄西林与双黄连注射液对其他亚型酶有无诱导或抑制作用,还不明确,因而下一步将研究氨苄西林与双黄连注射液对CYP1A2,CYP3A4,CYP2E1等其他亚型酶是否有影响,并运用WESTERNBLOT和PCR技术,深入到分子生物学角度去研究酶被诱导或抑制后其蛋白和基因的变化[8]。[参考文献][1]GAEDIGKA,BHATHENAA,NDJOUNTCHEL,ETAL.IDENTIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFNOVELSEQUENCEVARIATIONSINTHECYTOCHROMEP4502D6(CYP2D6)GENEINAFRICANAMERICANS[J].PHARMACOGENOMICSJ,2005,5(3)173-182.[2]杜智敏,朱波,张波.双黄连注射液与注射用青霉素钠配伍的稳定性及体外抑菌实验[J].哈尔滨医科大学学报,2003,37(4)330-332.[3]于卫江,黄丽军,刘艳,等.奥扎格雷钠对大鼠CYP2D6亚型酶的影响[J].中国药理学通报,2007,23(1)67-72.[4]MAXC,WANGHX,XINJ,ETAL.EFFECTSOFHUPERZINEAONLIVERCYTOCHROMEP450INRATS[J].ACTAPHARMACOLSIN,2003,24(8)831-835.[5]MEYERUA.OVERVIEWOFENZYMESOFDRUGMETABOLISM[J].JPHARMACOKINETBIOPHARM,1996,24(5)449-459.[6]闫淑莲,扈金萍,徐艳霞,等.COCKTAIL探针药物同时评价连翘对肝细胞色素P450的影响[J].中国药学杂志,2003,38(10)761-763.[7]SHINU,NORIKOH,MASANORIY,ETAL.EFFECTOFNONSPECIFICBINDINGTOMICROSOMESANDMETABOLICELIMINATIONOFBUPRENORPHINEONTHEINHIBITIONOFCYTOCHROMEP4502D6[J].BIOLPHARMBULL,2005,28(2)212-216.[8]郭阓,魏君丽.双黄连雾化吸入防治头颈部肿瘤急性黏膜放射反应[J].护理学杂志,2006,21(7)11-12.木瓜中等极性部位高效液相色谱指纹图谱研究陶君彦1,张晓昱1,黄志军2,熊富良2,张琼光2,肖飞2(1.华中科技大学生命科学与技术学院,武汉430072;2.武汉健民药业集团股份有限公司,武汉430052)[摘要]目的研究不同采收时间和不同炮制方法的木瓜药材中等极性部位指纹图谱,为木瓜的规范化种植与合理应用提供依据。方法以咖啡酸、绿原酸为参照物,采用高效液相色谱(HPLC)法测定分析各指纹图谱,色谱条件C18(KROMASILC18,10NM~5ΜM,4.6MM250MM)色谱柱;流动相(A)乙腈甲醇(64),(B)0.05%磷酸梯度洗脱,0~12MIN(10%~30%A,90%~70%B),~30MIN(30%~50%A,70%~50%B),~35MIN(50%~70%A,50%~30%B),~45MIN(70%~90%A,30%~10%B),~50MIN(90%~60%A,10%~40%B),~60MIN(60%~10%A,40%~90%B),~70MIN(10%A,90%B);流速0.8MLMIN1;检测波长283NM。结果木瓜中等极性部位指纹图谱有较好的相关性,木瓜不同采收时间的样品分为3大类,其中1~4批为一类,具有2个共有峰,5~7批为一类,具有3个共有峰,第8,9为一类,有3个共有峰;其中又以第5批采收时间最好,其次是第6,7批;不同炮制方法以晒制方法特征峰峰面积大;存放时间对于成分含量也有一定影响。结论该研究有助于木瓜的质量控制、采收和应用。[关键词]木瓜;中等极性部位;指纹图谱;色谱法,高效液相[中图分类号]R286;R927[文献标识码]A[文章编号]10040781(2008)05049403HPLCFINGERPRINTSTUDYONMIDDLEPOLARITYPARTOFCHAENOMELESFRUITTAOJUNYAN1,ZHANGXIAOYU1,HUANGZHIJUN2,XIONGFULIANG2,ZHANGQIONGGUANG2,XIAOFEI2(1.COLLEGEOFLIFESCIENCEANDTECHNOLOGY,HUAZHONGUNIVERSITYOFSCIENCEANDTECHNOLOGY,WUHAN430072,CHINA;2.WUHANJIANMINPHARMACYGROUPLIMITEDCOMPANY,WUHAN430052,CHINA)ABSTRACTOBJECTIVETOSTUDYTHEFINGERPRINTOFMIDDLEPOLARITYPARTFROMFRUITOFCHAENOMELESATDIFFERENTTIMEANDINDIFFERENTPROCESSMETHODS,WHICHCOULDPROVIDEGAPBASISFORPLANTINGANDREASONABLEAPPLICATION.METHODSHPLCWITHUVDETECTORWASUSEDTOANALYZETHEPATTERNSOFFRUITOFCHAENOMELES.COFFEICACIDANDCHLOROGENICACIDWEREUSEDASSTANDARDSUBSTANCES,C18(KROMASILC1810NM-5ΜM,4.6MM250MM)COLUMNWASUSEDWITHAMOBILEPHASEOF(A)ACETONITRILEMETHONAL(64)(B)0.05%PHOSPHORICACIDGRADIENTELUTION,0-12MIN(10%-30%A,90%-70%B),-30MIN(30%-50%A,70%-50%B),-35MIN(50%-70%A,50%-30%B),-45MIN(70%-90%A,30%-10%B),-494HERALDOFMEDICINEVOL27NO5MAY2008

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