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丙型肝炎病毒核心抗原检测技术国内外临床研究应用情况.doc

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丙型肝炎病毒核心抗原检测技术国内外临床研究应用情况.doc

丙型肝炎病毒核心抗原检测技术国内外临床研究应用情况(综述)张贺秋丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HEPATITISCVIRUS,HCV)感染引起的一种重要的世界性传染病。一般地,1520左右的HCV感染者为自限性感染,可以很快的康复。但是,也有8085的感染者发展为慢性丙型肝炎,其中又有20的可发展为肝纤维化,最终有45的肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌,危害十分严重。目前,慢性丙型肝炎除了干扰素有确切的疗效外,尚无其它有效的治疗药物。国际上近来报道,PEG修饰的干扰素加利巴韦林联合治疗可在4050左右的患者获得较好的反应,但也有疗程长、价格昂贵、毒副作用大以及易反弹等缺点。此外,丙型肝炎疫苗的研制也因HCV高度变异而困难重重,短期内难有突破性进展。因此,尽早检出HCV感染者,阻断HCV的传播是当务之急。1HCV检测技术的现状HCV一般通过被HCV污染的血液和血液制品传播,现在常用的HCV检测技术有两种方式(1)间接检测,主要检测抗HCV抗体;(2)直接检测,通过定性或定量检测HCV病毒粒子的组成成分确定病毒的存在,例如HCVRNA。这两种检测方式在确诊HCV感染,选择HCV感染者的治疗方案以及评价抗HCV治疗的疗效方面起到了关键作用。11抗HCV抗体的检测上世纪九十年代初,利用重组HCV抗原开发出了抗HCV抗体检测技术,即酶免疫分析(ENZYMEIMMUNOASSAYS,EIAS)技术,已经发展到第三代。该技术可检测样本中针对不同HCV抗原(如C区、NS3区、NS4区和NS5区等)的混合抗体,目前检测的特异性已高达99以上。由于缺乏更敏感的金标准,抗HCVEIA技术的敏感性还很难确定。在免疫健全的患者中,抗HCVEIA的检测敏感性高于99,几乎所有的HCV感染者都可以被检测出来。但对于正进行血液透析的患者和严重免疫缺损患者,虽然其体内有HCV复制活跃,但EIA检测可能就是阴性结果。为此,某些厂商又开发了免疫条带分析作为确证实验,如ORTHO公司开发的RIBA等。因第三代EIA在临床检测中表现良好,目前免疫条带分析在临床的实际应用的意义已不是很大。但因为在血站EIA检测结果阳性的阳性预测值(POSITIVEPREDICTIVEVALUE,PPV)相对较低,其在血站仍然有很大的用武之地。12HCVRNA的检测121定性检测HCVRNA定性检测中HCVRNA的存在被视为HCV病毒复制的标志。因其敏感性比现有的任何一种定量检测方法都要高,定性检测HCVRNA是非常有用的一种直接检测HCV是否存在的技术。该技术基于利用RTPCR技术或转录介导的扩增(TRANSCRIPTIONMEDIATEDAMPLIFICATION,TMA)技术特异性扩增HCV基因组RNA序列,又称为核酸扩增(NUCLEICACIDAMPLIFICATIONTECHNIQUES,NAT)技术。目前市面上的HCVRNA定性检测试剂的检测临界值为50HCVRNAIU/ML和10IU/ML,主要产品有ROCHE公司的COBASAMPLICORORAMPLICORHCVTEST,VERSION20;CHIRON公司基于TMA技术的PROCLEIXAHIV1/HCV,可一个反应同时检测HIV1RNA和HCVRNA。122定量检测HCVRNA样本中HCVRNA含量可通过NAT技术和信号扩增技术(分支DNA检测)来确定。目前市面上的HCVRNA定量检测试剂的最低检测临界值介于30IU/ML和615IU/ML之间,线性定量的上限在500,000IU/ML和7,700,000IU/ML之间。样本中病毒水平高于检测上限的,应稀释1/10或1/100后重新检测。HCVRNA定量检测结果不受HCV基因型的影响,而所谓的国际单位(INTERNATIONALUNIT,IU)是按WHOHCVRNA标准参比血清来确定的。为了比较不同HCVRNA定量检测试剂的检测结果和在全球推广,在不久的将来所有的HCVRNA定量检测试剂都应该采用此标准。目前市面上的HCVRNA定量检测试剂主要产品有基于分支DNA技术的BAYER公司VERSANT™HCVRNA30;基于竞争性PCR技术的ROCHE公司COBASAMPLICORORAMPLICORHCVMONITORTEST,VERSION20和ABBOTT公司LCXHCVRNAQUANTITATIVEASSAY。2现有常用检测技术的局限性21抗HCVEIA检测存在“窗口期”由于现有的第三代抗HCVEIA检测技术的特异性和敏感性已经很高,基本上能够检出所有的HCV感染者,使输血后丙型肝炎的发生率大大降低(美国在19971999年间为1/230,000,同期法国为1/700,000)。但是,在HCV感染后至抗HCV抗体产生之前还有一段约4070天的较长时期(平均66天)。此时,献血员已被感染并具有感染性,应用目前的第三代EIA检测试剂不能检出,称为感染后血清阳转前的窗口期(PRESEROCONVERSIONWINDOWPHASE,PWP)。PWP的存在,是输血安全的重要威胁之一,使受血者依然有经输入抗HCV筛选阴性的血液而感染HCV的危险,国内外已经有关于输入抗HCV筛选阴性的血液而感染HCV的报道。22HCVRNA检测难以普及由于在HCV感染后615天(平均11天)HCVRNA就在感染者血液中出现,并在血清阳转之前达到一个较高的水平,RNA滴度在100,000至100,000,000拷贝/ML之间。为了降低PWP感染的危险,缩短PWP以实现HCV感染的早期检测,许多国家引入敏感性很高的NAT检测技术对献血员进行常规筛选。敏感的NAT试剂可以检测出100至500份样品的混合血样中的HCVRNA。美国已开始对16至24份样品的混合血样进行NAT筛选,目前已经在16,300,000份血样中筛选出62份HCVRNA阳性血。尽管NAT检测在发达国家已经成功的筛选出了感染性献血员,但由于NAT技术需要昂贵精密的仪器、较高的实验技巧、试剂比较昂贵以及容易交叉污染导致假阳性偏高,使其很难推广到单个献血员,在发展中国家的应用也受到很大限制。3HCV核心抗原检测技术的进展31HCV核心抗原检测技术HCV核心抗原也是在HCV感染者体内出现的早期感染的标志,几乎与HCVRNA同时出现。目前已经开发出两种检测HCV核心抗原的ELISA检测试剂,一种是直接检测血清或血浆样品中的游离HCV核心抗原,另一种是检测血清或血浆样品中的总的HCV核心抗原。一般直接检测血清或血浆样品中的游离HCV核心抗原主要用于血液筛查以缩短窗口期,保证输血安全。而检测血清或血浆样品中总HCV核心抗原则用途较广,不仅可用于血液筛查,而且还可指导慢性丙型肝炎患者的治疗,判断预后。ABBOTT公司的MUERHOFF等研究出了一种基于微球的自动化化学发光免疫分析PRISMHCV核心抗原检测试剂,该方法首先以抗HCV核心抗原的单抗包被微球捕捉血清或血浆中的核心抗原,然后以丫啶色素结合的单抗检测捕获的抗原,利用单通道化学发光检测仪确定结果。检测14套血清阳转系列血清盘和1004名献血员的结果表明,该方法的特异性达999,与HCVRNA检测的符合率为986(69/70),平均可缩短窗口期327天,只比NAT检测时间晚066天(平均),这与其它报道HCV核心抗原检测检出时间比NAT检出时间晚1天左右是一致的。日本的KASHIWAKUMA等人也利用重组HCV核心抗原免疫BALB/C小鼠制备单抗建立了类似的荧光酶免疫分析技术,其所用的二抗是半乳糖苷酶结合的单抗,与相应的底物作用检测荧光。初步检测结果表明,该方法检测的HCV核心抗原定量与HCVRNA水平显著相关,可用于总HCV核心抗原的定量检测。31游离HCV核心抗原检测技术及应用游离HCV抗原检测试剂尤其适于在血清阳转前使用,可缩短HCV感染检测的窗口期约4050天,应用于献血员筛查可显著改善输血安全。ORTHO公司的PETERSON等人为了评价一种可检测血清中HCV核心抗原的ELISA检测试剂原型,通过24份血清阳转系列血清对抗HCV抗体、HCVRNA和HCV抗原出现时间进行了比较。结果表明,83(20/24)的样品中HCV核心抗原与HCVRNA同时检出。HCV核心抗原的平均检出时间只比HCVRNA晚约1天。总体来讲,87的HCVRNA阳性样品中含有可检测到的HCV核心抗原。PETERSON等认为,HCV核心抗原可在HCV感染后抗体阴性的窗口期通过常规的ELISA技术检出,对于缩短检测窗口期非常有用。军事医学科学院与景达基因公司的张贺秋等人利用其研制的HCV核心抗原ELISA检测试剂盒,通过对275万人献浆员,采用抗-HCV、HCVRNA和HCVCAG检测试剂进行连续两年的HCV感染状况跟踪研究。研究表明,对两年内确诊的11例HCV感染,HCV核心抗原诊断试剂、HCVRNA检测试剂较HCV抗体检测试剂对HCV感染后的检出时间缩短。HCV核心抗原诊断试剂较HCV抗体检测对HCV感染的阳性检测提前14-68天,平均352天;HCVRNA诊断试剂较HCV抗体检测时间对HCV感染的阳性检测提前19-68天,平均393天;HCVRNA诊断试剂较HCV抗原检测对HCV感染的阳性检测提前0-17天,平均41天。说明HCV抗原检测是一种适合我国国情缩短检测“窗口期”的简单有效经济的方法。ORTHO公司、景达基因公司推出了商业化的游离HCV核心抗原ELISA检测试剂,资料显示试剂可比已有的HCV抗体检测试剂早35天以上检测出HCV感染。更为重要的是,该方法操作快速、简便,可在3小时内获得结果,并且与现有的仪器设备兼容,适合用于献血员的大规模筛选。然而,一旦HCV感染者体内产生抗体发生血清阳转,抗核心抗原抗体与HCVCAG之间便可形成抗原抗体复合物,其检测的敏感性就大大降低了。32总HCV核心抗原检测技术及应用为了克服游离HCV核心抗原检测试剂的不足,AOYAGI等对样品进行了一步简单的预处理,将免疫复合物解离及病毒颗粒裂解后再行检测。预处理的方法十分简便,可以很好地与常规ELISA方法整合,使该方法可在更广泛的人群中应用,也进一步扩大了方法的用途。ORTHO公司开发了可定量检测血清或血浆中总HCV核心抗原的检测试剂TRACKC,无论抗HCV抗体存在与否均可使用。LAPERCHE等的研究发现,其敏感性比第一代用于血液筛查的检测游离HCV核心抗原ELISA试剂还要高,可以作为NAT试剂的替代产品用于窗口期HCV感染的诊断。VEILLON等人通过与两种HCVRNA定量分析方法QUANTIPLEXHCVRNA20(BDNAV20)或VERSANTHCVRNA30(BDNAV30)和COBASAMPLICORHCVMONITORVERSION20(HCMV20)进行比较研究,对该方法的敏感性、特异性和可重复性进行了评价。结果表明,对于不同的HCV基因型样品,该方法都取得了较好的结果,检测的批内和批间变异系数分别为511和995,在献血员中检测的特异性为995,与两种HCVRNA定量方法相比较有较好的相关性。MAYNARD等为确定总HCV核心抗原定量检测在预测PEG修饰的干扰素和利巴韦林联合治疗的反应性上的效果,利用ORTHO公司的总HCV核心抗原检测试剂和HCVRNA定量检测技术共同检测了116位接受联合治疗的患者的病毒血症情况。他们发现,在治疗前和治疗3个月后,总HCV核心抗原检测的反应预测性与HCVRNA检测相同,似乎总HCV核心抗原检测的效果在治疗早期(4周以内)要优于HCVRNA检测,在3个月后达到最佳效果。与HCVRNA检测相比,在监测治疗和预测PEG修饰的干扰素和利巴韦林联合治疗的反应性上,监测血清中总HCV核心抗原水平是一种精确和可靠的方法,可代替HCVRNA定量检测。4结语抗HCV抗体检测、HCVRNA检测和HCV基因分型技术已在临床和血站广为应用,为保证血供安全做出了重要贡献。而HCV核心抗原检测是近两年得到快速发展的一种新的检测HCV复制的间接指标,它的出现使克服抗HCVEIA筛选的局限缩短窗口期成为可能,而且总HCV核心抗原检测还可用于监控慢性丙型肝炎患者体内病毒载量,评价抗HCV治疗的效果。参考文献1ZANETTIAR,ROMANOL,BRUNETOM,ETALTOTALHCVCOREANTIGENASSAYANEWMARKEROFHEPATITISCVIREMIAFORMONITORINGTHEPROGRESSOFTHERAPYJMEDVIROL,2003;7027302PETERSONJ,GRENG,IIDAK,ETALDETECTIONOFHEPATITISCCOREANTIGENINTHEANTIBODYNEGATIVE‘WINDOW’PHASEOFHEPATITSCINFECTIONVOXSANG,2000,7880853LAPERCHES,LEMARRECN,SIMONN,ETALANEWHCVCOREANTIGENASSAYBASEDONDISASSOCIATIONOFIMMUNECOMPLEXESANALTERNATIVETOMOLECULARBIOLOGYINTHEDIAGNOSISOFEARLYHCVINFECTIONTRANSFUSION2003,437958624VEILLONP,PAYANC,PICCHIOG,ETALCOMPARATIVEEVALUATIONOFTHETOTALHEPATITISCVIRUSCOREANTIGEN,BRANCHEDDNA,ANDAMPLICORMONITORASSAYSINDETERMININGVIREMIAFORPATIENTSWITHCHRONICHEPATITISCDURINGINTERFERONPLUSRIBAVIRINCOMBINATIONTHERAPYJCLINMICROBIOL,2003,417321232205MAYNARDM,PRADATP,BERTHILLONP,ETALCLINICALRELEVANCEOFTOTALHCVCOREANTIGENTESTINGFORHEPATITISCMONITORINGANDFORPREDICTINGPATIENTSRESPONSETOTHERAPYJVIRALHEPAT2003;104318236ZANETTIAR,ROMANOL,BRUNETTOM,ETALTOTALHCVCOREANTIGENASSAYANEWMARKEROFHEPATITISCVIREMIAFORMONITORINGTHEPROGRESSOFTHERAPYJMEDVIROL2003;70127307EIRASA,FRANCOE,MONTOROJA,ETALHCVNATMINIPOOLRTPCRANDHCVCOREANTIGENELISATRANSFUSION2003;431118;AUTHORREPLY1181198LAGGINGLM,GARCIACE,WESTINJ,ETALCOMPARISONOFSERUMHEPATITISCVIRUSRNAANDCOREANTIGENCONCENTRATIONSANDDETERMINATIONOFWHETHERLEVELSAREASSOCIATEDWITHLIVERHISTOLOGYORAFFECTEDBYSPECIMENSTORAGETIMEJCLINMICROBIOL2002;4011422442299BOUVIERALIASMPATELK,DAHARIH,ETALCLINICALUTILITYOFTOTALHCVCOREANTIGENQUANTIFICATIONANEWINDIRECTMARKEROFHCVREPLICATIONHEPATOLOGY,2002;36121121810NUBLINGCM,UNGERG,CHUDYM,ETALSENSITIVITYOFHCVCOREANTIGENANDHCVRNADETECTIONINTHEEARLYINFECTIONPHASETRANSFUSION2002;4281037104511GRANTPR,SIMSCM,TEDDERRSQUANTIFICATIONOFHCVRNALEVELSANDDETECTIONOFCOREANTIGENINDONATIONSBEFORESEROCONVERSIONTRANSFUSION2002;4281032103612WIDELLA,MOLNEGRENV,PIEKSMAF,ETALDETECTIONOFHEPATITISCCOREANTIGENINSERUMORPLASMAASAMARKEROFHEPATITISCVIRAEMIAINTHESEROLOGICALWINDOWPHASETRANSFUSMED2002;12210711313MUERHOFFAS,JIANGL,SHAHDO,ETALDETECTIONOFHCVCOREANTIGENINHUMANSERUMANDPLASMAWITHANAUTOMATEDCHEMILUMINESCENTIMMUNOASSAYTRANSFUSION2002;42334935614WIDELLA,MOLNEGRENV,PIEKSMAF,ETALDETECTIONOFHEPATITISCCOREANTIGENINSERUMORPLASMAASAMARKEROFHEPATITISCVIRAEMIAINTHESEROLOGICALWINDOWPHASETRANSFUSMED2002;1221071315AOYAGIK,IIDAK,OHUEC,ETALPERFORMANCEOFACONVENTIONALENZYMEIMMUNOASSAYFORHEPATITISCVIRUSCOREANTIGENINTHEEARLYPHASESOFHEPATITISCINFECTIONCLINLAB2001;47341192716COUROUCEAM,LEMARRECN,BOUCHARDEAUF,EFFICACYOFHCVCOREANTIGENDETECTIONDURINGTHEPRESEROCONVERSIONPERIODTRANSFUSION2000;40101198120217AOYAGIK,OHUEC,IIDAK,DEVELOPMENTOFASIMPLEANDHIGHLYSENSITIVEENZYMEIMMUNOASSAYFORHEPATITISCVIRUSCOREANTIGENJCLINMICROBIOL1999;3761802180818TANAKAE,OHUEC,AOYAGIK,ETALEVALUATIONOFANEWENZYMEIMMUNOASSAYFORHEPATITISCVIRUSHCVCOREANTIGENWITHCLINICALSENSITIVITYAPPROXIMATINGTHATOFGENOMICAMPLIFICATIONOFHCVRNAHEPATOLOGY2000;3223889319IIJIMAA,TANAKAE,KOBAYASHI,ETALRELATIONSHIPBETWEENHISTOLOGICALPROGNOSISOFCHRONICHEPATITISCANDAMOUNTOFHEPATITISCVIRUSCOREPROTEININSERUMJGASTROENTEROLHEPATOL2000;153311920TANAKAE,KIYOSAWAK,MATSUMOTOA,ETALSERUMLEVELSOFHEPATITISCVIRUSCOREPROTEININPATIENTSWITHCHRONICHEPATITISCTREATEDWITHINTERFERONALFAHEPATOLOGY1996;2361330133321KASHIWAKUMAT,HASEGAWAA,KAJITAT,ETALDETECTIONOFHEPATITISCVIRUSSPECIFICCOREPROTEININSERUMOFPATIENTSBYASENSITIVEFLUORESCENCEENZYMEIMMUNOASSAYFEIAJIMMUNOLMETHODS1996;1901798922ICARDIG,ANSALDIF,BRUZZONEBM,ETALNOVELAPPROACHTOREDUCETHEHEPATITISCVIRUSHCVWINDOWPERIODCLINICALEVALUATIONOFANEWENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAFORHCVCOREANTIGENJCLINMICORBIO2001;39931103114

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