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不同粒径神经毒素-Ⅰ 纳米粒大鼠鼻腔给药脑药动学研究.pdf

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不同粒径神经毒素-Ⅰ 纳米粒大鼠鼻腔给药脑药动学研究.pdf

19942010CHINAACADEMICJOURNALELECTRONICPUBLISHINGHOUSEALLRIGHTSRESERVEDHTTP//WWWCNKINET不同粒径神经毒素2Ⅰ纳米粒大鼠鼻腔给药脑药动学研究包强,蔡鑫君,李范珠浙江中医药大学药学院,浙江杭州310053收稿日期20100204,修回日期20100322基金项目国家自然科学基金资助项目NO30772793,30371781;浙江省卫生高层次创新人才培养工程资助项目作者简介包强1984,男,硕士生,TEL0571286613726,E2MAILTUNSHU2008163COM;李范珠1964,男,教授,博士生导师,研究方向药物新剂型与新技术,通讯作者,TEL0571286633030;E2MAILLIFANZHUZJTCMNET中国图书分类号R2332;R32281;R452;R9691;R9776;R9963文献标识码A文章编号10011978201006073105摘要目的制备不同粒径甲基化聚乙二醇METHYLATED2POLYETHYLENEGLYCOL,ME2PEG修饰的神经毒素2ⅠNEUROTOXIN,NT2Ⅰ聚乳酸POLYLACTICACID,PLA纳米粒NT2Ⅰ2MEPEG2PLA2NP,NT2Ⅰ2NP,并考察不同粒径NT2Ⅰ2NP大鼠鼻腔给药后脑药动学特征。方法以聚乙二醇单甲醚聚乳酸共聚物MEPEG2PLA为纳米材料,采用复乳溶剂挥发法制备NT2Ⅰ2NP。以尾静脉注射NT2Ⅰ2NP为对照组,4组不同粒径NT2Ⅰ2NP大鼠鼻腔给药,运用脑微透析取样技术分析NT2Ⅰ在大鼠中脑导水管周围灰质PERIAQUEDUCTALGRAY,PAG部位浓度的经时变化。结果不同粒径的NT2Ⅰ2NP呈圆形或类圆形,大小均匀。大鼠鼻腔给药后小于100NM的NT2Ⅰ2NP的AUC02T分别是100~200、200~300和大于300NMNT2Ⅰ2NP的1122、1134、1160倍P0105,表明粒径小于100NM时NT2Ⅰ在脑靶部位的浓度明显高于其他粒径的纳米粒。结论纳米粒的粒径对NT2Ⅰ的脑内递送有着较为明显的影响,粒径小于100NM的NT2Ⅰ2NP可以明显增加NT2Ⅰ的脑内浓度,这一结果为研究适宜粒径的NP用于蛋白多肽类大分子药物入脑奠定了基础。关键词神经毒素;甲基化聚乙二醇;粒径;纳米粒;大鼠;鼻腔给药;微透析;脑药动学神经毒素2ⅠNEUROTOXIN,NT2Ⅰ是从云南眼镜蛇毒液中分离得到的一种短链神经毒素的主要成分,分子量约为6700U,是一种水溶性碱性多肽,其理化性质相对稳定1。NT2Ⅰ具有良好的镇痛作用,药理研究已表明2,3其作用部位为中枢神经系统,临床上主要以肌内注射方式用于控制各种疼痛及戒毒治疗,属于非麻醉性神经抑制剂4。但是NT2Ⅰ分子量相对较大和大多数水溶性大分子多肽类药物相似,不易透过血脑屏障BLOODBRAINBARRIER,BBB进入大脑,需要经过一个较长时间的给药过程才能在中枢靶部位蓄积到有效的治疗浓度,故起效缓慢,难以满足患者的治疗需求5。鼻腔给药IN2TRANASALADMINISTRATION,IN是研究较多的有望成为多肽类药物注射给药替代途径的新型药物传输系统之一6,它是一种实现多肽类药物脑内递药的有效方法,尤其适合透过BBB能力低的中枢性大分子极性药物。采用生物降解型高分子材料将蛋白多肽类药物制成纳米粒NANOPARTICLE,NP,可有效保护肽类药物的活性,并能实现缓释、控释和靶向释药目的7。本研究以聚乙二醇单甲醚聚乳酸共聚物MEPEG2PLA为载体材料,采用复乳溶剂蒸发法制备不同粒径的NT2Ⅰ2NP。采用微透析取样技术结合荧光分光光度法测定脑靶部位药物的浓度,探讨不同粒径NT2Ⅰ2NP大鼠鼻腔给药后脑药动学特征。1材料与方法11材料111药品与试剂神经毒素2Ⅰ中国科学院昆明动物研究所,质量分数99,批号060530;异硫氰酸荧光素神经毒素FITC2NT2Ⅰ,杭州中泰生物技术有限公司标记,批号CH205200301;聚乙二醇单甲醚聚乳酸共聚物山东岱罡生物科技有限公司,批号070601;泊洛沙姆188德国BASF公司,批号WPTB649C;右旋糖苷270美国SIGMA公司,批号1720280201;人工脑脊液自制145MMOLL1NACL,317MMOLL1KCL,110MMOLL1MGCL2,112MMOLL1CACL2,10MMOLL1NAH2CO3,011MMOLL1抗坏血酸,PH714;其余试剂均为国产分析纯。112仪器与设备超速离心机美国BECKMAN公司;超声波细胞粉碎机中国宁波新芝生物科技股份有限公司;小型冷冻干燥机美国LABCONCO公司;激光粒度测定仪/ZETA电位仪美国NICOMP公司;MODULUSTM单管型多功能光度计美国TURNERBI2OSYSTEMS公司;荧光分光光度计日本岛津公司;大鼠鼻黏膜给药装置专利号20052001352515;微透析脑立体定位架及实验装置系统美国BAS公137中国药理学通报CHINESEPHARMACOLOGICALBULLETIN2010JUN;266731~519942010CHINAACADEMICJOURNALELECTRONICPUBLISHINGHOUSEALLRIGHTSRESERVEDHTTP//WWWCNKINET司。113实验动物清洁级SD大鼠,♀♂兼用,体重约300G,由浙江中医药大学实验动物中心提供合格证号SCXK沪200720005。所有动物实验均按照浙江大学动物饲养和使用指南进行。12方法1214组不同粒径的NT2Ⅰ2NP制备称取40MGMEPEG2PLA溶于110ML乙酸乙酯中,精密加入40ΜL的FITC2NT2Ⅰ1GL1水溶液,涡旋乳化40S,再加入2ML泊洛沙姆188水溶液或右旋糖苷270,冰浴下探头超声乳化30S,将制得的复乳转移至013PVA水溶液100ML中,旋转蒸发30MIN除去有机溶剂,超速离心30000RMIN130MIN,并用蒸馏水洗涤3次,沉淀冻干后即得NT2Ⅰ2NP。122形态取4组不同粒径的NT2Ⅰ2NP胶体溶液适量,蒸馏水稀释后滴于覆盖碳膜的铜网上,室温放置至形成薄膜后用透射电子显微镜观察其形态。123粒径和Ζ电位取4组不同粒径的NT2Ⅰ2NP胶体溶液适量,用激光粒度仪测定其粒径、多分散系数P1I及Ζ电位。124包封率和载药量NT2Ⅰ的投料量计为C0,取离心后的上清液测定浓度计为C1,计算包封率C0C1/C0100;NT2Ⅰ2NP的浓度计为MNT2Ⅰ2NP冻干后的质量与胶体溶液的体积比即为M,计算载药量C0C1/M100。125溶液配制FITC2NT2Ⅰ溶液称取一定量的FITC2NT2Ⅰ溶液,置于2ML的容量瓶中,加人工脑脊液溶解并定容至刻度,得到浓度为1GL1的FITC2NT2Ⅰ人工脑脊液溶液对照品。FITC2NT2Ⅰ2NP溶液取按“11211”项下得到的NT2Ⅰ2NP适量,置于100ML的容量瓶中,均匀分散在人工脑脊液胶体溶液中既得。126标准曲线精密量取FITC2NT2Ⅰ溶液适量,置1ML容量瓶中用人工脑脊液定容,准确稀释至浓度为015、5、25、50、75、100ΜGL1标准系列溶液。以人工脑脊液为空白,在激发波长ΛEX488NM,发射波长ΛEM520NM下进行荧光测定,以荧光强度F对药物浓度ΡΜGL1进行线性回归,得到回归方程。127大鼠脑微透析手术操作SD大鼠水合氯醛300MGKG1IP麻醉,俯卧位固定于脑立体定位仪上。颅顶皮肤消毒后矢状切开大鼠头部正中皮肤,暴露颅骨。用牙科高速钻机在颅骨上钻开一直径约015MM的小孔。将微透析探针插入脑骨表面下614MM即左侧PAG部位,用牙托粉和螺钉将微透析底座固定在颅骨上,缝合皮肤。128微透析探针在体回收率测定8运用反透析法测定NT2Ⅰ微透析脑探针的在体回收率。按“11217”项下操作,微透析脑探针埋植手术结束后,使用浓度分别为10、50和100ΜGL1的FITC2NT溶液灌流,流速为2ΜLMIN1,每30MIN收集1次透析液,收集3H。采用单管型多功能光度计测定透析液中对照品浓度,根据公式回收率/CPERCDIACPER100计算探针在体回收率CDIA、CPER分别是透析液、灌流液中FITC2NT2Ⅰ对照品浓度。129NT2Ⅰ2NP鼻腔给药脑药动学取SD大鼠25只,随机分成5组,每组5只NP2Ⅰ尾静脉注射组NPIV、NP2Ⅰ鼻腔给药组NP2ⅠIN、NP2Ⅱ鼻腔给药组NP2ⅡIN、NP2Ⅲ鼻腔给药组NP2ⅢIN、NP2Ⅳ鼻腔给药组NP2ⅣIN。按“11217”项下进行手术,探针透析膜埋植手术结束后灌流人工脑脊液,流速2ΜLMIN1,平衡30MIN。采用大鼠鼻腔给药装置给药,剂量相当于60ΜGKG1的NT2Ⅰ,同时使用自动恒温冷冻收集器收集透析液,间隔30MIN,收集480MIN。透析液测定其荧光强度,并折算成NT浓度。通过NT2Ⅰ在体回收率校正,得到各时间点的脑内NT2Ⅰ实际浓度。1210数据处理与药动学参数的计算使用非隔室模型方法处理数据,计算相关药代动力学参数,CMAX、TMAX为实测值,AUC02T采用梯形法计算。用ORINGIN610软件进行方差分析及配对T检验,药物动力学参数见TAB2。2结果21NT2Ⅰ2NP形态不同粒径的NT2Ⅰ2NP外观为乳白色胶体溶液,电镜下呈圆球形,大小均匀。22NT2Ⅰ2NP的粒径、Ζ电位、包封率和载药量用复乳溶剂挥发法制备的不同粒NT2Ⅰ2NP的粒径、Ζ电位、包封率和载药量见TAB1。23透析样品测定的标准曲线结果表明,FITC2NT2Ⅰ在015~100ΜGL1范围内与荧光强度呈良好的线性关系,回归方程F751704Ρ51802N6,R019995。24FITC2NT2Ⅰ微透析探针在体回收率ITC2NT2Ⅰ微透析探针在PAG部位的在体平均回收率为1511111。该回收率用于透析部位药物实际浓度的校正。25NT2Ⅰ2NP的药时曲线与药动学参数大鼠脑微透析实验过程示意图见FIG1。4组不同粒径237中国药理学通报CHINESEPHARMACOLOGICALBULLETIN2010JUN;26619942010CHINAACADEMICJOURNALELECTRONICPUBLISHINGHOUSEALLRIGHTSRESERVEDHTTP//WWWCNKINETTAB1PARTICLESIZE,PI,ΖELECTRICPOTENTIAL,ENTRAPMENTEFFICIENCYANDLOADINGCAPACITYOFNT2Ⅰ2NPXS,N5PARTICLESIZE/NMPIΖELECTRICPOTENTIAL/MVENTRAPMENTEFFICIENCY/LOADINGCAPACITY/NP2Ⅰ7048601260059941538114295034010NP2Ⅱ1278123016600614911318150235042011NP2Ⅲ2668105008000312871088338322029012NP2Ⅳ322589003400221361368373343035008TAB2THEPHARMACOKINETICALPARAMETERSINPAGAFTERINTRANASALADMINISTRATIONOFFOURNT2Ⅰ2NPXS,N5PARAMETERNP2ⅠNP2ⅡNP2ⅢNP2ⅣNPIVCMAX/ΜGL1248915632164077182508116371881495190TMAX/H178008180012197005201009241016MRT/H332014359009362016371015398016AUC0T/ΜGHL1127011232△10369978944590989591074722615773P0105VSNP2Ⅱ,NP2Ⅲ,NP2Ⅳ;△P0105VSNP2Ⅱ,NP2Ⅲ,NP2ⅣNT2Ⅰ2NP大鼠鼻腔给药后的药时曲线见FIG2。药动学参数见TAB2。与尾静脉注射组NT2NPIV相比,4组不同粒径NT2Ⅰ2NP经鼻腔给药后的AUC0T、CMAX均高于静脉注射组P0105。NP2Ⅰ的AUC0∞、CMAX均高于NP2Ⅱ、NP2Ⅲ和NP2Ⅳ,而TMAX均小于其他3组P0105。FIG1SCHEMATICDIAGRAMOFRATBRAINMICRODIALYSISFIG2THEPROFILESOFMEANDRUGPAGCONCENTRATION2TIMEAFTERINTRANASALADMINISTRATIONOFFOURNT2Ⅰ2NPN53讨论根据文献和前期研究8,9发现,复乳溶剂挥发法制备NT2Ⅰ2NP时,乳化剂的种类与浓度、超声时间、稀释剂的浓度等因素对NT2Ⅰ2NP粒径大小都有影响,本实验通过改变乳化剂的种类泊洛沙姆188或右旋糖苷270和浓度泊洛沙姆188214和115,右旋糖苷270,016和115、超声时间30S、18S、15S、9S,制备4组不同粒径的NT2Ⅰ2NP,记做NP2Ⅰ、NP2Ⅱ、NP2Ⅲ、NP2Ⅳ。在中枢神经系统中从PAG到脊髓的下行抑制通路是比较肯定的与阵痛有关,即中脑PAG与中枢阵痛部位有着密切的联系10。PAG对痛觉有高度选择性抑制性作用,可调节GABA、谷氨酸等神经递质的释放11,12。所以,本实验中透析液采集选择PAG部位。鼻腔给药是一种实现多肽类药物脑内递药的有效方法之一,纳米粒作为多肽类药物的载体,粒径是影响其入脑的重要因素之一13。从TAB2可知,在给药剂量相同的前提下,4组鼻腔给药组的AUC0T和CMAX分别为12710112132ΜGHL1和241891156ΜGL1,1031699178ΜGHL1和211640177ΜGL1,941459109ΜGHL1和181250181ΜGL1,8915910174ΜGHL1和161371188ΜGL1,各组不同粒径NT2Ⅰ2NP经鼻腔给药后的AUC0T为静脉注射组NPIV的117、115、112、111倍P0101,CMAX为NPIV组的116、115、113、111倍,说明NT2Ⅰ2NP经鼻腔给药后药物脑内递送的程度和速度均优于静脉注射。可能的原因是由于鼻腔和颅腔在解剖和生理上的独特联系,药物可能绕过BBB经嗅区鼻脑通路直接进入脑内14,因此脑内药物浓度可能高于其它给药途径。鼻腔黏膜上皮只有一层纤毛柱状上皮细胞构成,而且上皮细胞下存在着丰富的毛细血管和毛细淋巴管。鼻腔给药后,少部分药物经过嗅神经通路和嗅黏膜上皮通路直接进入大脑,但大多数药物被呼吸道黏膜吸收进入血液循环,进而透过血脑屏障337中国药理学通报CHINESEPHARMACOLOGICALBULLETIN2010JUN;26619942010CHINAACADEMICJOURNALELECTRONICPUBLISHINGHOUSEALLRIGHTSRESERVEDHTTP//WWWCNKINET进入脑组织15。有研究认为16NP可能是通过BBB表面内皮细胞的胞转作用进入大脑,而且较小粒径的NP越容易透过BBB上的血管内皮细胞。本实验中,与NP2Ⅱ、NP2Ⅲ、NP2Ⅳ相比,NP2Ⅰ的AUC0∞分别为其它3组的1122、1134、1160倍P0105,CMAX分别为其它3组的112、113、115倍P0105。说明粒径对NP的入脑有着较为明显的影响,粒径小于100NM时NT2Ⅰ2NP可以明显增加NT2Ⅰ的脑内浓度。LOCKMAN等17提出,构建理想的入脑NP的粒径应小于100NM。KUO等18通过体外研究发现,随NP粒径增大,其体外BBB透过率降低。从药时曲线图及药动学参数可以看出,与NP2Ⅱ、NP2Ⅲ、NP2Ⅳ相比,NP2Ⅰ鼻腔给药后脑内浓度明显增加,入脑递送时间相对加快,但是脑内药物含量增加是否能提高NT镇痛作用,有待于药动学与药效学的结合研究,本课题组将进一步开展这方面的研究。采用微透析取样技术19对具有脑靶向性的药物进行药动学研究,透析液中的药物浓度真实的代表了脑靶部位细胞外液中非结合药物浓度的经时变化,而且取样技术不影响实验动物的正常生理功能。本实验以清醒自由活动的大鼠为实验模型,运用脑微透析技术研究了不同粒径NT2Ⅰ2NP鼻腔给药的脑内药物动力学过程。参考文献1CHENRZ,ROBINSONSETHEEFFECTOFCHOLINERGICMANIPULATIONSONTHEANALGESICRESPONSETOCOBROTOXININCOBROTOXININMICEJLIFESCI,1990,47211945542LUQM,MENGQX,LIDS,ETALCOMPARATIVESTUDYOFTHREESHORT2CHAINNEUROTOXINSFROMTHEVENOMOFNAJAKAOUTHIAYUNNAN,CHINAJJNATTAXINS,2002,11322193PHUIYEEJS,NANLINGG,AFIFIYANF,ETALSNAKEPOSTSYNAPTICNEUROTOXINSGENESTRUCTURE,PHYLOGENCYANDAPPLICATIONINRESEARCHANDTHERAPYJBIOCHIMIE,2004,862137494陈汝筑,吴秀荣眼睛蛇神经毒素的镇痛作用J中国药理学通报,1988,4211364CHENRZ,WUXRTHEANALGESICEFFECTOFNEUROTOXINFROMCOBRANAJANAJAVENOMJCHINPHARMACOLBULL,1988,4211365LIF,FENGJ,CHENGQ,ETALDELIVERYOF125I2COBROTOXINAFTERIN2TRANASALADMI2NISTRATIONTOTHEBRAINAMICRODIALYSISSTUDYINFREE2LY2MOVINGRATSJINTJPHARM,2006,328216176ILLUMLNASALDRUGDELIVERY2POSSIBILITIES,PROBLEMSANDSOLUTIONSJJCONTROLRELEASE,2003,8713187987VILAA,SANCHEZA,TOBIOM,ETALDESIGNOFBIODEGRADABLEPARTI2CLESFORPROTEINDELIVERYJJCONTROLLEDRELEASE,2002,781315248程巧鸳,李范珠神经毒素纳米粒大鼠鼻腔给药的脑药物动力学研究J中国药科大学学报,2007,3817798CHENGQY,LIFZBRIANPHARMACOKINETICSOFNT2Ⅰ2LOADEDNANO2PARTICLESAFTERINTRANASALADMINISTRATIONINRATSJJCHINAPHARMUNIV,2007,3817799KREUTERJNANOPARTICULATESYSTEMSFORBRAINDELIVERYOFDRUGJADVDRUGDELIVREV,2001,471658110FIELDSHL,HEINRICHERMMANATOMYANDPHYSIOLOGYOFANOCEP2TIVEMODULATORYSYSTEMJPHILOSTRANSRSOCLONDBBIOLSCI,1985,30811363617411唐敬师,袁斌一个新的痛觉调制通路的发现J西安交通大学学报医学版,2002,2343293211TANGJS,YUANBANEWDISCOVERYOFPAINMODULATIONPATHWAYJJXI’ANJIAOTONGUNIVNEDSCI,2002,2343293212龙瑞,杜俊蓉亲代谢型谷氨酸受体和相关神经疾病J中国药理学通报,2009,258998100112LONGR,DUJRMETABOTROPICGLUTAMATERECEPTORSANDRELATEDNERV2OUSDISEASESJCHINPHARMBULL,2009,258998100113GAOK,JIANGXINFLUENCEOFPARTICLESIZEONTRANSPORTOFMETHOTREX2ATEACROSSBLOODBRAINBARRIERBYPOLYSORBATE802COATEDPOLYBUTYL2CYANOACRYLATENANOPARTICLESJINTJPHARM,2006,31012213914ILLUMLTRANSPORTOFDRUGFROMTHENASALCAVITYTOTHECENTRALNERV2OUSSYSTEMJEURJPHARMSCI,2000,11111815蒋新国药物的鼻腔黏膜吸收J中国新药杂志,2003,1211902515JIANGXGINTRANASALDRUGDELIVERYJCHINJNEWDRUGS,2003,1211902516KUOYC,CHENHHEFFECTOFNANOPARTICULATEPOLYBUTYLCYANOAC2RYLATEANDMETHYLMETHACRYLATE2SULFOPROPYLMETHACRYLATEONTHEPER2MEABILITYOFZIDOVUDINEANDLAMIVUDINEACROSSTHEINVITROBLOOD2BRAINBARRIERJINTERJPHARM2006,32712160917LOCKMANPR,MUMPERRJ,KHANMA,ETALNANOPARTICLETECH2NOLOGYFORDRUGDELIVERYACROSSTHEBLOOD2BRAINBARRIERJDRUGDEVINDPHARM,2002,28111318KUOYC,CHENHHEFFECTOFNANOPARTICULATEPOLYBUTYLCYANOAC2RYLATEANDMETHYLMETHACRYLATESULFOPROPYLMETHACRYLATEONTHEPER2MEABILITYOFZIDOVUDINEANDLAMIVUDINEACROSSTHEINVITROBLOODBRAINBARRIERJINTJPHARM,2006,32712160919李范珠,冯健脑微透析技术及其在脑内药动学中的应用J中国药学杂志,2006,416405719LIFZ,FENGJBRAINMICRODIALYSISANDITSAPPLICATIONINTHEBRAINPHARMAC2OKINETICSJCHINPHARMJ2006,4164057THEBRAINPHARMACOKINETICALSTUDYOFDIFFERENTDIAMETERSNEUROTOXIN2ⅠNANOPARTICLESAFTERINTRANASALADMINISTRATIONINRATSBAOQIANG,CAIXIN2JUN,LIFAN2ZHUCOLLEGEOFPHARMACEUTICALSCIENCE,ZHEJIANGUNIVERSITYOFTRADITIONALCHINESEMEDICINE,HANGZHOU310053,CHINAABSTRACTAIMTOPREPARENT2ⅠLOADEDNANOPARTI2CLESWITHDIFFERENTDIAMETERSMODIFIEDBYMETHYLATED2437中国药理学通报CHINESEPHARMACOLOGICALBULLETIN2010JUN;26619942010CHINAACADEMICJOURNALELECTRONICPUBLISHINGHOUSEALLRIGHTSRESERVEDHTTP//WWWCNKINETPOLYETHYLENEGLYCOLME2PEGANDEVALUATETHEIRBRAINPHARMACOKINETICSAFTERADMINISTEREDNASALLYINRATSMETHODSNT2Ⅰ2NPWASPREPAREDBYEMULSION/SOL2VENTEVAPORATIONMETHODANDMEPEG2PLAWASUSEDASTHECARRIERMATERIALMICRODIALYSISTE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