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参附注射液对大鼠脑缺血再灌注后Bcl 一2 和Bax 蛋白表达的影响'.pdf

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参附注射液对大鼠脑缺血再灌注后Bcl 一2 和Bax 蛋白表达的影响'.pdf

93参附注射液对大鼠脑缺血再灌注后Bcl一2和Bax蛋白表达的影响于腊梅杨丽娟蒋淑君滨州医学院生理学教研室滨州市256603【摘要】目的观察大鼠局灶性脑缺血再灌注后海马Bcl2、Bax蛋白的表达及参附注射液对其的影响。方法成年雄性SD大鼠30只,随机分为假手术组、模型组、参附注射液治疗组。采用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞middlecerebralarteryocclusion,MCAO再灌注模型,应用TIC染色检测脑梗死体积,免疫组织化学法检测海马CAI区Bcl2、Bax蛋白的表达。结果缺血组大鼠海马CAI区Bcl.2、Bax蛋白的表达较假手术组明显增加P0.01,给予参附注射液处理后,Bcl2蛋白表达明显增加PO.01,Bax蛋白表达减少P0.05,差异均有统计学意义。结论参附注射液可以通过调节Bcl2、Bax蛋白表达来抑制细胞凋亡,这可能是其发挥脑保护作用的机制之一。【关键词】参附注射液脑缺血再灌注Bcl2Bax【中图分类号】R743.3【文献标识码】A【文章编号】10019510201002009303TheeffectofShenfuinjectionontheexpressionofBcl2andBaxinratswithcerebralischemiareperfusionYULameiYANG埘u锄JIANGShujunDepartmentofPhysiology。BinzhouMedicalUniversityBinzhou256603【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofShenfuinjectionontheexpressionofBcl2,Baxinratswithcerebralischemiareperfusion.MethodsThe30maleSpragueDawleyratsweredividedinto3groupsshamoperationgroup。cerebralischemiagroupandShenfuinjectionintenremedgroup.ThemodelratswereestablishedbythemiddlecerebralarteryocclusionMCAOwithLongagmethods.TheinfarctvolumeswerestudiedbyTYCstainingandimmunohistochemitrymethodwereusedtodetecttheexpressionofBcl2Bax.ResultsComparedwiththeshamoperationgroup。theexpressionofBcl2。BaxincreasedobviouslyincerebralischemiagroupP0.01.AftergivedShenfuinjection,theexpressionofBcl2proteinincreasedmarkedlyP0.01,andtheexpressionofBaxproteinreducedP0.05.CondmionThroughregulatingtheexpressionofBcl2andBaxprotein,Shenfuinjectioninhibitsapoptosisafterthetransientcerebralischemiarepeffusion.【Keywords】Shenfuinjection,cerebralischemiareperfusion,Bcl2Bax参附注射液Shenfuinjection,SF是由中医治疗厥脱证休克著名古方参附汤加工提炼而成,为红参和黑附片的提取物,主要成分为人参皂苷和乌头类生物碱【11其基本药理作用为增加冠脉血流及血管灌注量,延长动物耐缺氧时间,保护缺血心肌等i近年来,已有文献报道参附注射液对脑缺血再灌注损伤后神经元的凋亡具有保护作用,可能与NFKB、TNF.amRNA等有关口J。在脑缺血再灌注后,缺血中心区的神经元死亡以坏死形式为主,而半暗带区的神经元死亡与凋亡有关。细胞凋亡的过程受到许多凋亡基因的调控。Bcl2、Bax就是其中非常重要的凋亡基因,在凋亡过程中发挥着重要作用。为此,作者观察了参附注射液对脑缺血再灌注损伤后海马Bel2、Bax表达的变化,以阐述其脑保护作基金资助项目滨州医学院科技计划项目编号BY2007KJ04用的具体机制,为参附注射液的临床应用提供实验依据。1材料和方法1.1实验动物及所用试剂健康成年雄性SD大鼠30只,体重200~250g,由滨州医学院实验动物中心提供。参附注射液为雅安三九药业有限公司生产,Bel2、Bax免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司。1.2动物分组及模型制备将动物随机分为假手术组、模型组、sF治疗组,每组10只。参照LongaJ栓线法复制大鼠左侧大脑中动脉闭塞middlecerebralarteryocclusion,MCAO模型。大鼠以10%水合氯醛350ms/kg腹腔内注射麻醉,仰卧固定,颈部正中切口,分离并暴露左侧颈总动脉及颈内、外动万方数据94脉,结扎颈总动脉及颈外动脉根部,由颈总动脉近分叉处剪一小口插入尼龙线,插入长度约18~20mm时感到有轻微阻力时停止,扎紧并固定插线,缝合皮肤,阻断血流2h后,拔线实现再灌注24h。假手术组仅分离左侧颈总动脉,SF治疗组于术前l周开始至术后再灌注24h,每天一次。一共8d,都是采用腹腔注射的方法注射参附注射液,剂量为10ml/kg。1.3行为学评分各组大鼠在处死前观察其神经系统症状的变化,按Longa【3J5分法标准进行评分,0分无神经损伤1分不能完全伸展右侧前肢2分向右侧转圈3分向右侧倾倒4分不能自发行走,意识水平下降。1~4分为模型成功并人组继续后续试验死亡者和少于1分者弃去并重新补入成功模型制备动物,继续后续试验。1.4TFC染色测定脑梗死体积进行行为学评分后,各组大鼠取5只测定脑梗死体积。快速断头取脑,切除嗅脑、低位脑干及小脑后,从额极向枕极作厚度为2mm的冠状切片,脑片置于2%TTC溶液中37℃恒温下避光染色30min。染色后正常脑组织呈红色,而梗死灶呈白色。再将脑片置入10%甲醛中固定24h,用计算机病理图像分析仪计算出梗死灶体积,各脑片梗死灶体积之和即为梗死体积。1.5组织切片的制备及Bcl2、Bax检测各组大鼠取5只在深麻醉状态下打开胸腔,心脏快速相继灌注温生理盐水和4%多聚甲醛各250ml。灌注完毕后快速断头取脑,常规固定、石蜡包埋,在切片机上连续切片,片厚5m,用SP法进行免疫组化染色,检测Bcl一2、Bax。严格按照试剂盒说明书操作,DAB显色,显微镜下控制反应时间,常规封片,镜下观察。1.6统计学处理所有数据均以戈4s表示,用SPSSl3.0统计软件包进行统计学处理,组问比较采用单因素方差分析ANOVA和两两比较t检验,P0.05为差异有统计学意义。2结果2。1神经行为症状评分结果模型组大鼠术后出现明显的神经功能缺陷症状,大多数表现为右侧前肢屈曲,行走时向右侧偏移,神经行为症状评分与假手术组比较有显著性差异P0.01参附注射液治疗组大鼠与脑缺血模型组比较有差异尸0.05,结果见表1。2.2各组大鼠脑梗死体积检测结果假手术组脑组织染成红色,未见梗死灶。各缺血组大鼠脑组织可见明显梗死灶,尤其模型组大鼠可见梗死范围广泛,涉及皮层、皮层下组织和海马等区域而SF治疗组脑梗死体积缩小,与模型组比较有显著差异P0.01,结果见表1。2.3海马CAl区Bcl2、Bax的表达Bcl.2免疫反应阳性产物呈棕黄色,位于细胞核内,胞浆空白Bax免疫反应阳性产物亦呈现棕黄色,位于细胞核及胞浆内。假手术组见少量Bcl2、Bax阳性细胞表达。模型组海马CAl区Bcl2、Bax阳性细胞数明显增多,呈强阳性表达P0.01。参附注射液治疗组与模型组相比Bcl2免疫阳性细胞数明显增多P0.01,而Bax免疫阳性细胞数减少P0.05,结果见表1。表1各组神经功能缺损评分、脑梗死体积、Bcl2和Bax免疫阳幢细胞数的比较±s组别晶评分mm38d。2k假手术组003.60±1.146.80±2,39模型组3.20±1.03187.61±11.1316.80±4.3227.加±5.94SF治疗组2.20±O.92。123.78±10.32631.60±4.45△18.80±4.604注模型组与假手术组比较|P0.OlSF治疗组与模型组比较P0.05。△PO.Ol3讨论脑缺血损伤后,在缺血程度较重的核心区发生不可逆神经元坏死,缺血程度较轻的半影区则表现为细胞凋亡。如果迅速恢复脑缺血半影区的血供,可以抑制缺血神经元凋亡,改善神经元的生存环境,对缺血性脑损伤有积极的保护作用HJ。目前已知在凋亡发生过程中有许多凋亡相关基因的参与,包括凋亡抑制基因和凋亡诱导基因。Bcl2家族在神经细胞的凋亡过程中不可缺少的,Bcl2是一个凋亡抑制基因,Bcl2蛋白可以通过减少细胞内、核内浓度,直接控制线粒体外膜通透性的改变从而阻止凋亡信号的转导J。Bax是重要的促凋亡基因,其诱导凋亡的机制是Bax同源二聚体的形成,Bcl2蛋白的抑制凋亡作用则要通过与Bax结合形成异源二聚体来实现。Bcl2/Bax组成一个平衡体系,Bax过表达则细胞凋亡加速,Bcl2过表达则细胞凋亡被抑制,Bcl2/Bax的比率决定细胞凋亡是否发生帕J。本实验结果显示大鼠脑缺血再灌注后海马Bax蛋白表达增加,提示形成同源二聚体诱导细胞凋亡Bcl2蛋白表达反应性增加,与Bax蛋白结合形成异源二聚体发挥抑制凋亡的作用。参附注射液主要成分为人参皂苷和乌头碱,分别为红参和黑附片的提取物。研究报道,参附注射下转第108页万方数据108用法国Moria公司最新推出的一次性90自动旋转式抛弃型刀头制作角膜瓣,未发生角膜瓣的术中并发症。对高度或超高度近视术后眩光的发生,多出现在常规激光切削。常规激光切削是指单区域切削,由于角膜表面是非球面的,要在角膜中央区得到目标切削深度,屈光度越大,切削深度就越深,这样势必在光学周边区切削较多的组织。以往的激光技术在修边功能方面稍有欠缺,致使高度近视尤其超高度近视患者,因角膜基质切削深度的变化,在切削区周围形成一陡峭的锐角,因此产生眩光的几率增加而最新生产的EC5000CXII准分子激光系统,充分考虑到修边功能的作用,特别是在多区切削时,不但能减少切削深度的30%~40%,节省更多的角膜组织,更主要的是可使周边有平缓的过渡区,使切削区和正常角膜组织间夹角由锐角变钝角,从而减弱了光线的折射,使眩光大为改善HJ。本组病例眩光的发生率为3例4只眼10.57%,虽较国内宋建军1报道的7.5%稍有差别,可能与样本量有关,即便有眩光的产生,大多数患者在1个月左右基本恢复正常,严重的3个月左右恢复。有学者报道,多区切削时发生偏中心的几率较高4。我们认为只要术前重视,充分向患者交代做好同视训练,术中注意对焦,术中密切观察患者的配合程度,此并发症是完全可以避免的,本组病例术后地形图检查无偏心病例的发生说明了这一点。总之,一次性90刀头联合多区切削LASIK手术可安全有效的治疗高度近视,最大限度的保留角膜基质床的厚度,防止医源性角膜扩张的发生,且患者术后视力恢复快,屈光度相对稳定,自觉症状轻微,值得推广应用。参考文献1陈跃国,夏英杰,仲燕莹.M2抛弃型显微角膜刀头制作角膜瓣可预测性分析J.眼科,2005,143155157.2MariaCS,PiebengaLW,DeitzMR,以aLExcimerretreatformyopiaphotorefractivekeratoctomyfailuressixto18monthfollowupJ.Ophthalmology.1996。103444451.3苏东风,涨风菊,鲁智利。等.LASIK术后屈光回退多因素分析J.眼科新近展,2006,262130132.4SeilerS,AndreasH。MatthiasD.ComplicationsofmyopiaphotorefraetivekemteetomywiththeexcimerlaserJ,Ophthalmology,1994,101153160.5宋建军.LASIK单中心多区切削治疗高度近视J.眼外伤职业眼病杂志附眼科手术,2006,286458459.收稿日期201003一lo上接第94页液对脑、心、肝、肾缺血再灌注损伤、休克等具有一定的保护作用¨8J。对于其作用机制的研究发现,参附注射液能明显抑制心肌细胞凋亡【910J。而参附注射液对种经细胞凋亡的影响目前国内报道较少。本研究发现参附注射液治疗组大鼠海马CAl区Bcl2蛋白表达增加,Bax蛋白表达减少,从而发挥其抑制神经细胞凋亡,保护脑组织的作用。参附注射液作为一种纯中药制剂,已经应用于临床脑缺血疾病的治疗.并且取得了良好的疗效,具有广泛的应用前景。因此,对其缺血再灌注损伤理论进一步的研究和探索,将有助于对参附注射液更加合理有效科学的利用,更好的发挥中成药特有的优势。参考文献1吴红金,余少平,谢芳.参附注射液的临床应用与机制研究J.中国自然医学杂志,2004,62120123.2张秀玲,刘玉萍,扬欢.等.参附注射液对大鼠拿脑缺血再灌注时核转录因子KB表达的影响J.卒中与神经疾病,2008,156363366。3LongaEZ,WeinsteinPR。CarlsonS,et以.ReversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcranieetomyinratsJ.Stroke,1989.2018491.4CurrieRW,EllisonJA,WhiteRF。eta/.BenignfocalischemicpreconditioninginducesneuronalHs070andprolongedastrogliosiswithexpressionofHsp27J.BrainRes,2000,86312169181.5ZhuY,PrelmJH,CulmseeC,eta1.The132一adrenoeeptoragonistclenbuterolmodulatesBcl2,BclxlandBaxproteinexpressionfollowingtransientforebrainisehemiaJ.Neur。1999,90412551263.6Yao舵,NguyenTV.PikeC。eta/.pAmyloidinducedneuronalapoptosisinvolvescqunNterminalkinase.dependentdowaregulationofBcl.wj.jNeur,2005,2551149一1158.7IjuXY,ZouHD,YuJF.ProtectiveeffectofShenfuinjectiononmultipleOrgandamageinrabbitduringisehenha/reperfusionJ.ChinJAnesthesiol,1997,177430432.8】LuoW,WanLQ.MaCY.TheneuroproteetiveeffectofShenfusolutioninlunginjwyinducedbysepticshockinrabbitsJ.ChinCritiCareMed,1995。726870.9杨柳清,刘欣,蔡伟华,等.参附注射液对缺血再灌注细胞凋亡的影响J.广州医学院学报,2005,3312022.10张晓膺,郑世营.赵军。等.参附注射液对缺氧心肌细胞凋亡的抑制效应J.江苏医药。2005,312113一116.收稿日期20100314万方数据

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