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侧脑室注射苯并(a) 芘对大鼠脑组织形态, NO, iNOS 和脂质过氧化的影响.pdf

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侧脑室注射苯并(a) 芘对大鼠脑组织形态, NO, iNOS 和脂质过氧化的影响.pdf

环境与职业医学2008年4月第25卷第2期JENVIRONOEEUPMED,APR.2008V01.25NO.2117文章编号1006.3617200802.0117.04中图分类号R114文献标识码A侧脑室注射苯并A芘对大鼠脑组织形态、NO、INOS和脂质过氧化的影响聂继盛1,石樱桃2,牛侨件,王国强1,周燕1【论著】摘要目的研究苯并A芘BAP对大鼠脑组织形态、一氧化氮NO、诱导型一氧化氮合酶INOS、超氧化物歧化酶SOD和丙二醛MDA水平的影响,探讨BAP的神经毒性作用及机制。方法健康雄性SD大鼠40只,按体重编号后随机分为5组,分别为空白对照组生理盐水、溶剂对照组二甲基亚砜、BAP0.5、5、50MMOL/L组,每组8只,侧脑室注射各溶液10肛L。1周后,断头处死,取大脑半球。作病理切片,光镜观察大鼠神经细胞变化。应用试剂盒测定脑NO、INOS、MDA和SOD水平。结果病理切片显示,对照组小脑、海马神经细胞基本正常,各剂量组小脑、海马神经细胞病变随苯并A芘浓度增大而加重,表现为小脑蒲肯野细胞数目逐步减少,坏死细胞增多;海马神经细胞排列逐渐紊乱,数目逐步减少,坏死细胞增加,高剂量组表现最为典型。各剂量组与对照组比较,大鼠脑组织中NO、INOS、MDA增高,差异有统计学意义P0.05;大鼠脑组织中SOD下降,差异有统计学意义P0.05。结论BAP染毒大鼠脑组织出现了明显病理变化,NO及INOS的水平升高,SOD活性降低,MDA含量升高。关键词苯并A芘;脑组织形态;NO;脂质过氧化;神经毒性INTRACEREBROVENTRICULARLNJECTIONOFBENZOAPYRENEINDUCESCHANGESINMORPHOLOGY,NITRICOXIDE,INDUCIBLENITRICOXIDESYNTHASEVARIATIONSANDLIPIDPEROXIDATIONINRAT’SBRAIN眦JISHEN91.S肌YINGTA02,NLUQIAOU,张RANGGUOQIANGL,ZHOUYANI、1.DEPARTMENTOFOCCUPATIONALHEALTH,SCHOOLOFPUBLICHEALTH,SHANXIMEDICALUNIVERSITY,SHANGXI,TAIYUAN03000L,CINA;2.SHANXICANCERHOSPITAL,SHANGXI。TAIYUAN03013。CHINAABSTRACTOBJECTIVETOEXPLORETHEEFFECTSOFNITRIEOXIDENO,INDUCIBLENITRICOXIDESYNTHASEINOS,SUPEROXIDEDISMUTASESOD,MALONALDEHYDEMDAANDACUTENENROEYTECHANGESINDUCEDBYBENZOAPYRENEINRATS.METHODSFORTYMALESDRATS,ADULTANDHEALTHY,WEREDIVIDEDINTO5GROUPSRANDOMLY,NAMELYNORMALCONTROL,DMSOCONTROL,BAP0.5MMOL/L,BAP5MMOL/L,ANDBAP50MMOL/L.A儿RATSINDIFFERENTGROUPSWEREADMINISTEREDBYINTRACEREBROVENTRICULARINJEETIONOF10此RELEVANTSOLUTION.THEMORPHOLOGYOFNEUROEYTEINRATS’HIPPOCAMPUSANDCEREBEUUMWEREOBSERVEDBYOPTICALMICROSCOPE.LEVELSOFNO,INOS,SODANDMDAINRATS’BRAINWEREDETECTEDBYTESTKITS.RESULTS】THEOBSERVATIONUNDEROPTICALMICROSCOPESHOWEDTHATINCEREBELLUMANDHIPPOCAMPUS,ARRANGEMENTANDNUMBEROFTHENEUROEYTESWERENORMALINCONTROLGROUP,BUTWITHTHEINCREASINGOFTHEDOSESOFBAPADMINISTERED,THEARRANGEMENTOFNEUROCYTESBECAMEDISORDERED,THEIRNUMBERBECAMEDIMINISHED,EVENSHOWEDNECROSISAPPEARANCE.INRAT’SBRAINTHE’CONTENTOFNO,MDAANDTHEACTIVITYOFINOSWERESIGNIFICANTLYHIGHERINTREATMENTGROUPSTHANINTHECONTROLGROUP,WHILETHEACTIVITYOFSODW85SIGNIFICANFLYDEC/EASEDINTREATMENTGROUPS.CONCLUSIONSJBAPCANDAMAGEBRAINTISSUEANDCHANGETHELEVELSOFNO、INOS,SODANDMDA.KEYWORDSBENZOAPYRENE;MORPHOLOGYCHANGES;NITRICOXIDE;LIPIDPEROXIDATION;NEUROTOXICITY苯并A芘BENZOAPYRENE.BAP是确认人类致癌物,对神经系统影响鲜有报道。目前研究表明,BAP0以透过血脑屏障进入大鼠脑组织,还能通过嗅神经直接进入大脑,对大鼠行为学观察显示神经毒性作用与血浆BAP浓度和脑内BAP代谢物浓度明显相关‘引,此前的初步研究发现多环芳烃可引起基金项目国家自然科学基金资助项目编号30471437作者简介聂继盛1975。男,博士生,讲师,研究方向神经毒理学通讯作者CORRESPONDENTAUTHOR牛侨教授.EMAIL._NIUQIA055163.COM作者单位1.山西医科大学公共卫生学院,山西太原030001;2.山西省肿瘤医院,山西太原030013焦炉作业工神经行为改变,主要表现为对情感状态及记忆力功能的影响,且与脂质过氧化有关3,多环芳烃神经行为毒性对作业工人的危害可能是一个重要的职业卫生问题。情感状态及记忆功能是中枢神经的高级功能,而BAP是多环芳烃类物质的代表,为进一步研究BAP是否可直接引起中枢神经系统损害,本研究拟通过大鼠侧脑室注射BAP,观察脑组织形态和对一氧化氮NO、诱导型一氧化氮合酶INOS、超氧化物歧化酶SOD和丙二醛MDA的影响。1材料与方法1.1动物染毒与分组健康雄性SD大鼠40只,体重250~3009,活动能力相近,万方数据118环境与职业医学2008年4月第25卷第2期JENVIRONOECUPMED,APT.2008V01.25NO.2由山西医科大学实验动物中心提供,称重后按体重编号,将动物随机分为5组空白对照组、溶剂对照组和BAP50MMOL/L高、5MMOL/L中、0.5RNMOL/L低组,每组8只,用25%乌拉坦0AML./1009髓腹腔注射麻醉后,将大鼠置于立体定向仪上,固定鼠头,酒精棉球擦拭头部皮毛,剪去头毛,暴露头部皮肤,取正中切口,剪开约1.5CM长,钝性分离皮下组织,手术刀刮净骨膜,清晰暴露前囟十字缝。准确找到并标记前卤十字缝交点,自该点向后移动1.31.5MM,然后再向左或向右水平移动至1.5MM处,用牙科钻钻至硬脑膜下3.54.0MM深,将插管缓慢插入硬脑膜下4MM,502胶水固定插管,微量进样器通过插管分别向3组大鼠侧脑室内缓慢注入高、中、低浓度BAP溶液10汕,溶剂对照组注射二甲基亚砜DMSO10皿,空白对照组注射生理盐水10此后,溶剂对照组和各剂量组再分别注入生理盐水23此以保证BAP溶液及DMSO被完全注入。缝皮,注意保护插管。大腿三角肌注入青霉素1.0ML以抗感染。此后每天定时观察,肌注青霉素1.0ML抗感染。染毒后7D将动物断头处死,剥离颅骨。至枕骨大孔以上快速摘取全脑组织于冰皿上,沿矢状缝切取半个脑全脑,包括小脑,4%中性甲醛溶液固定24H后,石蜡包埋,制作病理切片。另半侧脑均保存于一20℃冰箱内,备用。1.2主要仪器及试荆BAP,纯度99%SIGMA公司;DMSO,分析纯天津市化学制剂一厂;NO、INOS、SOD、MDA试剂盒南京建成生物工程研究院;双缩脲蛋白检测试剂盒中生北控生物公司。微量迸样器上海安亭微量进样器厂;立体定向仪,江湾I型C上海第二军医大学;高速冷冻离心机上海安亭科学仪器厂;H92一II超声波细胞粉碎机上海新芝生物技术研究所。DA1.3NO、INOS、SOD和MDA的测定将冷冻组织从冰箱取出后,切下约0.39脑组织按L10比例加入生理盐水至3ML。超声波细胞粉碎机6MIN6次粉碎细胞,制成10%组织匀浆,4℃1000G离心,10RAIN,取上清勿将沉淀吸出。按照双缩脲蛋白检测试剂盒测定蛋白,然后按照NO、INOS、SOD、MDA试剂盒说明测定NO、INOS、SOD、MDA。1.4统计学分析所有数据用SPSS10.0进行方差分析和两两比较。2结果2.1一般情况.动物插管给药后,各组都出现活动减少、反应迟钝、进食减少、昏睡;3D后,中、高剂量组部分大鼠出现动作迟缓、步态蹒跚,少数表现烦躁易惊,对照组和低剂量组仅表现为活动减少。无其他明显异常行为改变。2.2病理结果光镜观察到,空白对照组小脑蒲肯野细胞数目形态正常,海马神经细胞排列整齐,数目形态正常;溶剂对照组小脑和海马未见明显病理改变,随着BAP剂量的增高,神经细胞损伤越严重,各剂量组小脑、海马神经细胞病变随BAP浓度增大而加重,表现为小脑蒲肯野细胞数目逐步减少,坏死细胞增多;海马神经细胞排列逐渐紊乱,数目逐步减少,坏死细胞增加。特别是高剂量组有典型的神经细胞损伤现象,表现为小脑蒲氏细胞数目减少,部分细胞出现坏死表现,胞核聚集、浓缩、溶解;海马神经细胞出现排列紊乱,数目减少,胞质透明,核皱缩。见图1、图2。BE图L各组小脑浦肯野细胞病理结果HE400LFIGURELCHANGESOFTHEPURKINJECELLSINDIFFERENTGROUPSCA.生理盐水对照组浦肯野细胞THEPURKINIECELLSOFNSCONGONLGROUPB.溶剂对照组浦肯野细胞THEPURKLNJECELLSOFDMSOGROUPC.低剂量组浦肯野细胞THEPURKINJECELLSOFBAP0.5MMOL/LGROUPD.中剂量组浦肯野细胞THEPURKINJEEELHOFBAP5MMOL/LGROUPE.高剂量组浦肯野细胞THEPURKINJECELLSOFBAP50MMOL/LGROUP万方数据环境与职业医学2008年4月第25卷第2期JEN“MNOEEUPMED,APR.2008V01.25NO.2119ABDE图2各组海马病理结果LHE400FIGURE2CHANGESOFHIPPOCAMPUSINDIFFERENTGROUPS2.3大鼠脑NO、INOS、SOD和MDA测定结果随BAP量的增加,INOS活性增高,NO的含量增多,各剂量组与空白对照组和溶剂对照组比较差异有统计学意义P0.05;高剂量组NO及INOS活性虽比中剂量组有所降低,但高剂量组NO与中剂量组比较差异无统计学意义P0.05,而高剂量组INOS与中剂量组比较差异有统计学意义P0.05。而随着BAP量的增加,SOD活性下降,MDA含量增多,中、高剂量组与对照组比较差异有统计学意义P0.05;高剂量组SOD活性虽低于低剂量组,高于中剂量组,但3组间差异无统计学意义P0.05,见表L。表L染毒大鼠脑NO、INOS、SOD和MDA测定结果IJTABLE1THECONTENTOFNO,INOS。SODANDMDAINRAT’SBRAINMEANSD空白对照组BLANKCONTROL溶剂对照组SOLVENTGROUP0.1320.095O.10L0.070109.38Q24.791.920.270.14640.0990.1190.096106.7117.101.940.33BAP0.5MMOL/LO.1720.066O.1980.10691.2937.272.190.41BAP5MMOL/L0.2704O.178’0.6280.150‘66.4614.13。2.8240.35‘BAP50MMOL/L0.183T0.150‘O.2970.141’85.3421.30’3.290.97注‘与空白对照组和溶剂对照组比较COMPAREDWITHBLANKCONTROLGROUPANDSOLVENTGROUP。P0.053讨论有关BAP神经毒性的研究非常少见,最新国外研究表明,BAP急性染毒大鼠的行为学观察显示,BAP神经毒性作用与其血浆及脑内代谢物浓度明显相关㈨。亦有文献报道BAP毛ECA.生理盐水对照组海马HIPPOCAMPUSOFNSCONRONLGROUPB.溶剂对照海马HIPPOCAXNPUSOFDMSOGROUPC.低剂量组海马HIPPOCAMPUSOFBAP0.5MMOL/LGROUPD.中剂量组海马HIPPOCAMPUSOFBAP5MMOL/LGROUPE.高剂量组海马HIPPOEAMPUSOFBAP50MMO/LGROUP一定条件下具有体外神经毒性【4,显示BAP可能具有神经毒性。而BAP造成脑组织形态改变的仅见一项报道小鼠亚慢性腹腔注射BAP发现,光镜及电镜下观察神经组织,高剂量组可见较为集中的坏死区;中剂量组可见少量细胞坏死,而细胞器形态改变较为普遍;低剂量组可见少量细胞发生细胞器形态改变‘引。本研究组以上述亚慢性研究的相同剂量给大鼠腹腔注射BAP2个月,仅观察到部分生化指标的改变,未能复制出明显中毒模型,大鼠行为学和组织形态学都未发生明显变化。而且,BAP的急性毒性很小,大鼠经I1LD501000MG/KG6】,NAP能否引起明显的脑形态改变对于确证其神经毒性作用及敏感作用部位具有重要的意义。本研究通过侧脑室注射给药的方式,精确定量大鼠脑组织接触BAP的剂量,成功地复制了动物模型,病理切片显示,BAP对大鼠的大脑海马神经细胞及小脑蒲肯野细胞具有明显毒性作用,且随着染毒浓度的增高,损伤越明显,表明BAP可引起脑实质细胞的损伤。NO是一种自由基性质的气体,具有独特的理化特性和多种生物学功能,如松弛血管平滑肌、抑制血小板聚集,作为逆行信使,调控突触可塑性等,然而,过量NO也可产生毒性作用7。外源性化学物或炎症等病理状态下可诱生INOS,产生过量的NO,NO又可与细胞内过量的超氧阴离子嘎结合生成过氧化亚硝酸根ON00一,产生强烈的神经毒性,导致神经元损伤,甚至死亡,发挥其神经毒作用N’9。有研究表明BAP可引起鲫鱼脑内INOS活性升高及NO的过量产生1引,本次研究发现诱导型INOS活性存在随着BAP浓度的增大而增高趋势;NO的含量随BAP浓度的增大而增高。可见BAP可能通过诱生INOS,产生过量NO引发自由基反应,导致了脑损伤,但在万方数据120环境与职业医学2008年4月第25卷第2期JENVIRONOEEUPMED,APR.2008V01.25NO.2BAP50MMOL/L组其INOS活性和NO含量均有减小,提示可能是因为高剂量BAP产生大量自由基,破坏INOS的作用,致NO含量也减少,这种现象在BAP诱导猪血管内皮细胞INOS表达中也有发现【11J。现已证明,脂质过氧化是BAP致癌作用的重要作用机制之一,也是导致哺乳类动物细胞损伤的主要机制12,”。脑组织含大量的多不饱和脂肪酸,氧耗量大且抗氧化水平低,氧自由基产生多,故脑细胞对氧自由基的过氧化反应特别敏感。脂质过氧化是脑内氧化应激的常见形式1引。MDA是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸,引起脂质过氧化的代谢产物之一,MDA的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度;而SOD是超氧阴离子的特异性清除剂,SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。本研究结果表明,中、高剂量组大鼠脑组织中SOD活性下降,MDA含量呈上升,表明BAP可引起脑实质的脂质过氧化,BAP的神经毒性可能与脂质过氧化有关。本次研究发现高剂量组SOD活性低于对照组,但比中剂量组有所升高,可能由于高剂量组NO生成减少。降低了其对SOD的硝基化作用而使其活性比中剂量组有所升高1引,也可能是自由基生成急剧增多,脑中应激性的SOD活性增高,其具体原因有待进一步探讨。综上所述,BAP可引起脑形态改变,其神经毒性可能与脑NOS活力、NO含量、SOD活力、MDA含量改变有关。虽然脑室注射与实际接触方式有很大区别,但脑中具有BAP活化代谢的所有酶类【1引,能够部分模仿实际接触的情形,而且在本次研究中BAP较为特异地引起海马和小脑的神经细胞损害。海马和小脑是学习记忆功能和手工敏捷度的主要控制中枢,人群研究中焦炉工神经行为功能降低可能与此有关。脑室注射可准确定量,其应用BAP的体积小,可减少操作人员的接触,不失为研究BAP神经毒性的一个方法。BAP为脂溶性物质,本次研究为确证BAP是否可引起脑病理损伤,所应用的浓度较高,因而选用了二甲基亚砜DMSO作为溶剂,DMSO虽具有一定的神经毒性,本次仅为单次注射,DMSO并未引起脑组织形态的改变。本次研究脑病理改变与BAP剂量间有一定的剂量一反应关系,为下一步的慢性染毒剂量选择提供了依据。参考文献【1JPERSSONE。LARSSONP.TJALVEH.CELLULARACTIVATIONANDNEURONALTRANSPORTOFINTRANASALLYINSTILLEDBENZOAPYRENEINTHEOLFACTORYSYSTEMOFRATSJ.TOXICOLLETT。2002.13323211219.【2JSAUNDERSCR,RAMESHA。SHOCKLEYDC.MODULATIONOFNEUROTOXICBEHAVIORINF344RATSBYTEMPORALDISPOSITIONOFBENZOAPYRENEJ.TOXICOLLETT。2002.129123345.3王芳,张红梅.聂继盛,等.焦炉工血中脂质过氧化水平与神经行为变化的关系J.中华劳动卫生职业病杂志,2007,25115一17.4TANGY。DONNELLYKC。TIFFANYCASTIGLL0NIE.NEUROTOXICITYOFPOLYCYCLICAROMATICHYDROCARBONSANDSIMPLECHEMICALMIXTURESJ.JTOXICOLENVIRONHEALTH,2003,6610919940.5涂白杰,陈胜,肖成峰.苯并A芘对小鼠神经毒性的光镜、电镜及行为学研究J.工业卫生与职业病,2002,2829498.6KNUCKLESME,INYANGF,RAMESHA.ACUTEANDSUBCHRONICORALTOXICITIESOFBENZOAPYRENEINF344RATSJ.TOXICOLCI,2001,612382388.7寿天德.神经生物学M.2版.北京高等教育出版社,200613M131.8DAWSONVL。DAWSONTM,BARTLEYDA,ETA1.MECHANISMSOFNITRICOXIDEMEDIATEDNEUROTOXICITYINPRIMARYBRAINCULTURESJ.JNEUROSCI,1993.13626512661.9RUBBOH,RADIR,TRUJILLOM,ETA1.NITRICOXIDEREGULATIONOFSUPEROXIDEANDPEROXYNITRITEDEPENDENTLIPIDPEROXIDATION.FORMATIONOFNOVELNITROGENCONTAININGOXIDIZEDLIPIDDERIVATIVESJ.JBIDCHEM.1994,269422606626075.10胡俊峰,王丕文,张春玲,等.BAP对鲫鱼全脑NO、NOS水平的影响J.中国公共卫生,2005,212186187.11徐增光,杨进波,文冠华,等.苯并A芘对血管内皮细胞一氧化氮合酶表达的影响J.工业卫生与职业病。2004,306353355.12KIMHS,KWACKSJ,LEEBM.LIPIDPEROXIDATION,ANTIOXIDANTENZYMESANDBENZOAPYRENEQUINONESINTHEBLOODOFRATSTREATEDWITLIBENZOAPYRENEJ.CHEMBIOLINTERACT,2000,1272139150.13LEBELCP,BONDYSC.OXYGENRADICALSCOMMONMEDIATORSOFNEUROTOXICITYJ.NEUROTOXLCOLTERATOL,1991,133341.346.14FLOYDRA.ANTIOXIDANTS,OXIDATIVE|RESSANDDEGENERATIVENEUROLOGICALDISORDERSJ.PROCSOCEXPBIOLMED,1999,222323岳245.15谢克勤,赵丽,张曼,等.氯丙烯对神经细胞NO、MDA、GSH含量和NOS、SOD活性的影响J.卫生毒理学杂志,2000,144212213.16STROBELHW,THOMPSONCM,ANTONOVICL.CYTOCHROMEP450INBRAINFUNCTIONANDSIGNIFICANCEJ.CURTDRUGMETAB,2001,22199214.收稿日期20074410校对丁瑾瑜万方数据

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