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单次氯胺酮注射对孕鼠子代认知功能的研究.pdf

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单次氯胺酮注射对孕鼠子代认知功能的研究.pdf

基础研究单次氯胺酮注射对孕鼠子代认知功能的研究于俊芳蒋奕红岳毅刚林高翔田小琳DOI10.3760/CMA.J.ISSN.1674-6554.2011.09.007基金项目广西区卫生厅科研项目(Z2010263),广西区卫生厅重点科室科研项目(重2010053)作者单位541001桂林,桂林医学院附属医院麻醉科通信作者蒋奕红,EMAILJIANGYIHONG@163.COM【摘要】目的探讨单次氯胺酮注射对孕鼠子代在空间认知能力、探索能力方面的行为学改变。方法3月龄SD同胞雌大鼠12对,用随机数字表法分为4组(N=6)对照组(N),小剂量氯胺酮组(K1),临床麻醉剂量氯胺酮组(K2),大剂量氯胺酮组(K3),与同龄SD同胞雄鼠4只按雌雄比例2∶1同笼交配受孕。K1、K2、K3组在孕鼠敏感致畸期(6~15D)的第10天分别以3,8,20MG/KG行尾静脉单次注射氯胺酮,N组单次注射生理盐水2ML。在孕鼠子代20D时进行旷场实验测试(记录新生大鼠在中央格停留时间(S)和2MIN内穿越的格子数)和洞板实验(计数5MIN内大鼠伸入洞的次数)。结果旷场试验中,N、K2、K3组中央格停留时间分别是(2.451.23)S,(6.422.50)S,(6.412.19)S。与N组比较,K2组和K3组新生大鼠在中央格停留的时间明显高(F=13.42,P<0.01),K1组无明显增高[(3.271.74)S,T=1.33,P>0.05)]。K1、K2、K3组穿越格子数减少[(15.336.81)个,(13.755.93)个,(16.926.54)个,F=4.24],差异有显著性(P<0.05)。洞板试验中,各组间比较,孕鼠子代的探洞次数差异无显著性(F=2.17,P>0.01)。结论相当于临床麻醉剂量的氯胺酮单次静脉注射能影响孕鼠子代的空间认知能力;但对其探索认知能力无明显影响。【关键词】氯胺酮;孕鼠子代;认知功能THEEFFECTSOFKETAMINEONLEARNINGANDMEMORYFUNCTIONINTHEPREGNANTRAT’SOFFSPRINGYUJUNFANG,JIANGYIHONG,YUEYIGANG,LINGAOXIANG,TIANXIAOLIN.DEPARTMENTOFANESTHESIOLOGY,AFFILIATEDHOSPITALOFGUILINMEDICALCOLLEGE,GUILIN541001,CHINA【ABSTRACT】OBJECTIVETOINVESTIGATEWHETHERPREGNANTRATSEXPOSURETOKETAMINECAUSEOFFSPRINGCHANGESINSPACECOGNITIVEABILITIESANDEXPLORATIONABILITIES.METHODS3MONTHSPRAGUEDAWLEYFEMALERATS(N=24)WERERANDOMLYDIVIDEDINTOFOURGROUPSGROUPN(CONTROLGROUP),GROUPK1(SMALLDOSESOFKETAMINEGROUP),GROUPK2(CLINICALANESTHESIADOSEOFKETAMINEGROUP),GROUPK3(LARGEDOSESOFKETAMINEGROUP).3MONTHSPRAGUEDAWLEYMALERATS(N=4)ANDFEMALERATSWEREMATEDATTHESAMECAGEBYTHEPROPORTIONOF2∶1.PREGNANTMICEWERETREATEDATTENTHDAYGROUPNWERETREATEDSALINEWITHEQUALVOLUMETOKETAMINEVEININJECTION;GROUPK1,GROUPK2,GROUPK3ADMINISTEREDVEININJECTION3,8,20MG/KGOFKETAMINE.THENTHE20DAYOFFSPRINGRATS'LEARNINGANDMEMORYWEREASSESSEDUSEDOPENFIELDTEST(RECORDTHETIMEOFTHEOFFSPRINGINTHECENTRALCASETHROUGHTHENUMBEROFGRIDWITHIN2MIN)ANDHOLEBOARDTEST(COUNTINGTHETIMESOFOFFSPRINGSTRETCHINTOTHEHOLEIN5MIN)ATPOSTNATALDAYS20.RESULTSINTHEOPENFIELDTEST,THERETENTIONTIMEINCENTRALCHECKOFGROUPN,GROUPK2ANDGROUPK3WERE(2.451.23)S,(6.422.50)S,(6.412.19)S.COMPAREDWITHGROUPN,THERETENTIONTIMEINCENTRALCHECKOFGROUPK2ANDGROUPK3WERESIGNIFICANTLYHIGHER(F=13.42,P<0.01),ANDGROUPK1WERENOTSIGNIFICANTDIFFERENT(T=1.33,P>0.01),ANDTHELOCOMOTIONOFGROUPK1,GROUPK2,GROUPK3WERESIGNIFICANTLYREDUCED((15.336.81),(13.755.93),(16.926.54),F=4.24,P<0.05).INTHEHOLEBOARDTEST,THETIMESOFOFFSPRINGSTRETCHINTOTHEHOLEWERENOTSIGNIFICANTDIFFERENTCOMPARINGWITHTHECONTROLGROUP(F=2.17,P>0.05).CONCLUSIONTHEDOSEOFKETAMINETHATEQUIVALENTEDCLINICALANESTHESIACANAFFECTOFFSPRINGRATS’SPACECOGNITIVEABILITIES;BUTTHEEXPLORINGCOGNITIVEABILITYWERENOTSIGNIFICANTLYINFLUENCED.【KEYWORDS】KETAMINE;PREGNANTRATS,OFFSPRING;COGNITIVEFUNCTION认知功能是脑的高级功能之一,一直是人们研究的热点。已有研究表明,麻醉药物、手术、年龄、心理因素、应激反应、患者的病理生理等因素均会对脑的认知功能产生抑制作用[1]。氯胺酮是唯一具有确切镇痛作用的麻醉药,由于其起效快作用时间短,常用于儿科麻醉及一些短小手术。胎儿期大脑神经细胞处于快速生长发育期,对外界环境具有高度敏感性。由于氯胺酮具有再增加麻醉剂量也不能使麻醉时间延长反而使毒副作用增多的特点,其对大脑发育毒性的研究一直是一个热点。本实验拟研究不同剂量氯胺酮作用于孕鼠的敏感致畸期,旨在探讨出氯胺酮与孕鼠子代认知功能之间的量效关系,为临床孕产妇及小儿用药的合理选择和发育毒性的预防治疗提供理论依据。材料与方法一、材料1.药品盐酸氯胺酮注射液(批号091127,福建古田药业有限公司)。787中华行为医学与脑科学杂志2011年9月第20卷第9期CHINJBEHAVMED&BRAINSCI,SEPTEMBER2011,VOL.20,NO.92.动物选择及分组3月龄SD同胞雌大鼠12对(200~250G)及雄大鼠2对(300~350G),购于桂林医学院动物实验中心。将雌雄大鼠分别采用随机数字表方法随机分为对照组(N组,雌N=6,雄N=1),小剂量氯胺酮组(K1组,N=6,雄N=1),临床麻醉剂量氯胺酮组(K2组,N=6,雄N=1),大剂量氯胺酮组(K3组,N=6,雄N=1)。二、方法1.孕鼠模型的建立为排除非干预因素的干扰,整个实验过程保持在同一环境和温度下。同胞雌大鼠和雄大鼠在安静环境下饲养后,将雌雄大鼠按2∶1比例同笼喂养。按照大鼠的生活周期,予第1天下午5∶00雌雄大鼠同笼,第2天上午8∶00检查雌大鼠阴栓的有无作为判断大鼠受孕的标准,若症状不明显对雌鼠作阴道涂片,以查到精子,记为受孕1D,以此类推,直至所有大鼠受孕完毕。2.给药为排除实验干扰因素,在孕鼠敏感致畸期(6~15D)的第10天给药,N组单次尾静脉注射生理盐水2ML,K1、K2、K3组分别以3,8,20MG/KG(用生理盐水稀释至2ML)的剂量行尾静脉氯胺酮单次注射。记录雌鼠怀孕过程中出现流产、疾病、致畸等情况。随机选取每窝中健康新生大鼠2只,继续与雌鼠同笼饲养进入实验。3.行为学实验测试动物行为学测试采用公认的方法测试,具有一定的可靠性。所有行为学实验均在一安静、隔音效果好的小屋内完成(241)℃。(1)旷场实验[2]子代在20D龄时测试。去顶盖木箱,底板(60CM60CM)及四壁(60CM高)为灰色划线,箱底用墨线分为36个等份小方格,摄像枪位于底板中央上方180CM处。实验时,将待测新生大鼠自中央格放入,观察新生大鼠在中央格停留时间和2MIN内穿越的格子数(以小鼠身体中心进入格内为准)。每只新生大鼠实验结束后,仔细擦尽其粪G22尿渍。其中,大鼠在中央格停留的时间用于评估大鼠的空间认知能力,2MIN内穿越格子数测试其对周围环境的好奇性及适应性。(2)洞板实验[3]用于测试大鼠的空间探索能力,是针对大鼠具有先天性探洞的习惯而设计的。选一个11.5CM11.5CM的平台(平台自身高2CM),亮出试验台面15CM,平台上有四个直径(1.6CM)相同的圆洞。将20D龄大鼠放入,计数5MIN内大鼠伸入洞的次数以至少眼入洞为标准。实验过程中,测试时间内每个洞穴的进入总次数将能被精确记录。4.统计处理采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析,计数资料采用多个样本率间的多重比较方法中的SCHEFF,法;计量资料中数据以均数标准差表示,对于正态分布且方差齐的资料采用单因素方差分析的单向分类的方差分析;若资料中方差不齐,则进行变量变换后单因素方差分析,组间比较采用单因素方差分析和SNKQ检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果一、孕鼠一般情况观察在实验过程中孕鼠一般情况可,尚未发现流产、畸形等不良情况。在K2组发现死胎,其中产8死6,产5死3。对各组孕鼠的死产率进行统计分析,结果得各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。因此孕鼠的死产并不能影响实验结果的统计学意义。二、各组仔鼠场旷实验结果比较经氯胺酮处理过的孕鼠子代K1、K2、K3组新生大鼠在中央格停留时间分别是(3.271.74)S,(6.551.49)S,(6.412.19)S,与N组(2.451.23)S比较,K2组、K3组新生大鼠在中央格停留的时间明显增高(F=13.42,P<0.01),而K1组和对照组(N组)比较差异无统计学意义(T=1.33,P>0.05);给药组新生大鼠穿越的格子数分别是(15.336.81)个,(13.755.93)个,(16.926.54)个,与N组(21.673.73)个相比,各组新生大鼠穿越格子数明显减少(F=4.24,P<0.05),而给药组新生大鼠之间比较可见差异显示无统计学差异(F=1.71,P>0.05),见表1。三、各组仔鼠洞板试验结果比较新生大鼠对照组[(11.413.20)次]及各组间[(11.172.12)次,(8.833.27)次,(8.674.23)次]相比,各组大鼠5MIN内进入洞悬的次数比较差异无统计学意义(F=2.17,P>0.01),见表1。表1各组新生大鼠空间认知能力和探索能力的比较(每组N=12,XS)组别场旷实验中央各停留时间(S)2MIN穿越格子数(格)洞板实验5MIN探头次数(次)N2.451.2321.673.73C11.413.20K13.271.7415.336.81A11.172.12K26.422.50BC13.755.93B8.833.27K36.412.19BC16.926.54A8.674.23注与N组相比,AP<0.05,BP<0.01;与K1组相比,CP<0.01讨论氯胺酮是NMDA受体非竞争性拮抗剂。研究显示,在灵长类大脑发育的敏感期(围产期)给予24H氯胺酮持续暴露可导致大脑长时间的损害并证实在大脑发育的关键时期接受全身麻醉可导致以后的功能障碍[4]。从脑功能方面讲,大鼠3月龄以前为发育早期大鼠[5]。本实验选用在孕鼠的敏感致畸期给予氯胺酮干预,此阶段是孕鼠对外界环境变化的易感期及胎鼠大脑的快速发育期。以往试验中大多采用对麻醉鼠自身的研究,本实验选用处理对象是孕鼠而行为学测试对象是孕鼠子代,以此探讨氯胺酮与认知功能之间的量效关系,此研究方法在国内外尚未见报道。在动物试验研究中,氯胺酮与认知功能之间尚无明确的量效关系,目前尚无确切定论。氯胺酮的临床常用剂量为静脉给药(1~2)MG/KG,本实验通过人和887中华行为医学与脑科学杂志2011年9月第20卷第9期CHINJBEHAVMED&BRAINSCI,SEPTEMBER2011,VOL.20,NO.9动物的剂量换算可得大鼠静脉注射8MG/KG[6]的剂量,其药效作用相当于临床麻醉剂量,根据预实验结果选择氯胺酮的高剂量和低剂量分别是20MG/KG、3MG/KG。在大量动物实验研究中,已证明氯胺酮可以诱发大量神经元的凋亡,引起动物不同程度的认知功能障碍。由于认知功能表现在学习记忆,空间探索能力,对伤害性刺激的防御能力等多个方面,本实验采用不同的行为学测试方法对大鼠的多种认知功能进行综合测定,使实验结果更全面。单次大剂量或多次小剂量注射氯胺酮均可引起多个脑区出现坏死的神经元[7]。本实验结果发现,K2、K3组在中央格停留的时间明显延长,K1组与N组指标差异无统计学意义,结果提示在孕鼠的敏感致畸期单次静脉注射小剂量氯胺酮并不能导致孕鼠子代在空间认知能力上的障碍,但是相关临床麻醉剂量及大剂量氯胺酮均可影响未成年大鼠的空间认知能力,以往研究结果也证实氯胺酮能够降低生长发育期大鼠的认知功能[810]。本实验结果还提示,给药组新生大鼠穿越的格子数明显减少,说明氯胺酮可使孕鼠子代降低对新异环境的兴奋性、适应性,且无剂量依赖性,从侧面反映出氯胺酮可降低神经系统的敏感性和兴奋性。蒯建科等[11]给新生1周WISTAR大鼠腹腔注射氯胺酮后,均持续麻醉6H,麻醉后21D进行旷场实验发现各组大鼠在旷场中央格的停留时间及穿越的方格数差异无统计学意义。本实验结果和上述结论相矛盾,其原因可能是由于大鼠的认知能力与氯胺酮的给药剂量、持续时间和给药次数以及大脑发育期的给药时期等有关,已有研究显示活体试验中神经毒性并不是麻醉药对细胞的直接毒害而是取决于大脑早期发育阶段对麻醉药物的暴露时期[12]。氯胺酮诱导的神经毒性依赖于氯胺酮的剂量和暴露的持续时间[13]。本研究结果显示,在孕鼠敏感致畸期单次注射不同剂量氯胺酮并不能导致孕鼠子代在探索能力上外在的行为学改变,但是其在分子水平的研究有待进一步深入。参考文献[1]OLNEYJW,ISHIMARUMJ,BITTIGAUP,ETAL.ETHANOLINDUCEDAPOPTOTICNEURODEGENERATIONINTHEDEVELOPINGBRAIN.APOPTOSIS,2000,5515521.[2]SHIMADAA,OHTAA,AKIQUCHII,ETAL.AGERELATEDDETERIORATIONINCONDITIONALAVOIDANCETASTINTHESAMP/10MOUSE,ANANIMALMODELOFSPONTANEOUSBRAINATROPHY.BRAINRES,1993,608266272.[3]LAMBERTYY,GOWERAJ.AGERELATEDCHANGESINSPONTANEOUSBEHAVIORANDLEARNINGINNMR1MICEFROMMIDDLETOOLDAGE.PHYSIOLBEHAV,1992,518188.[4]PAULEMG,LIM,ALLENRR,ETAL.KETAMINEANESTHESIADURINGTHEFIRSTWEEKOFLIFECANCAUSELONGLASTINGCOGNITIVEDEFICITSINRHESUSMONKEYS.NEUROTOXICOLTERATOL,2011,33220230.[5]HOFFMANNH,HUNTP,SPEARNE.ONTOGENETICDIFFERENCESINTHEASSOCIATIONOFGUSTATORYANDTACTILECUESWITHLITHIUMCHLORIDEANDFOOTSHOCK.BEHAVNEURALBIOL,1990,53441450.[6]徐叔云.药理实验方法学.2版.北京人民卫生出版社,1991201209.[7]CURRANHV,MORGANC.COGNITIVE,DISSOCIATIVEANDPSYCHOTOGENICEFFECTSOFKETAMINEINRECREATIONALUSERSONTHENIGHTOFDRUGUSEAND3DAYSLATER.ADDICTION,2000,95575590.[8]蒯建科,韩丽春,柴伟,等.新生大鼠氯胺酮麻醉后认知功能的远期改变和机制.中国行为医学科学,2007,16789791.[9]沈伯雄,渠兴乾,程志军,等.氯胺酮对新生鼠学习记忆功能的长期影响.上海交通大学学报(医学版),2010,30196199.[10]谈大海,张焰,曾因明,等.东莨菪碱与氯胺酮对幼鼠海马乙酰胆碱酯酶和NMDA受体2B亚基MRNA的相互影响.中华行为医学与脑科学杂志,2009,18982984.[11]蒯建科,姚立农,于代华,等.氯胺酮对新生大鼠神经功能和海马谷氨酸受体及转运体表达的影响.临床麻醉学杂志,2007,23218220.[12]CAMPBELLLL,TYSONJA,STACKPOLEEE,ETAL.ASSESSMENTOFGENERALANAESTHETICCYTOTOXICITYINMURINECORTICALNEURONESINDISSOCIATEDCULTURE.TOXICOLOGY,2011,28317.[13]MELLONRD,SIMONEAF,RAPPAPORTBA.USEOFANESTHETICAGENTSINNEONATESANDYOUNGCHILDREN.ANESTHANALG,2007,104509520.(收稿日期2011-04-02)(本文编辑冯学泉)读者作者编者远程投稿、查稿、审稿、编辑系统启事本刊采用远程稿件采编系统进行投稿、查稿等,现就有关问题说明如下。1.作者投稿登录本刊网站下载模版,使用模版编辑稿件,登陆在线投稿系统,按操作提示投稿。原则上不再受理邮寄稿件和EMAIL稿件。2.稿件查询使用作者注册用户名和密码,登陆在线查稿系统,可查询作者稿件审理进程和费用信息等。3.远程审稿审稿人使用用户名、密码登陆在线审稿系统,按操作提示审稿。4.远程编辑编辑使用用户名、密码登陆在线编辑系统,按操作提示进行稿件编辑处理。有关投稿、稿件查询,远程审稿,远程编辑的详细要求,请登陆本刊网站首页浏览。网站登录HTTP//WWW.XWYX.CN(戚厚兴)987中华行为医学与脑科学杂志2011年9月第20卷第9期CHINJBEHAVMED&BRAINSCI,SEPTEMBER2011,VOL.20,NO.9

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