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动态浊度法定量测定注射用阿洛西林钠细菌内毒素含量.pdf

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动态浊度法定量测定注射用阿洛西林钠细菌内毒素含量.pdf

1500,要求低于中华人民共和国药典2005年版。实验中发现以DMF为溶剂时,甲醇的峰形顶空法较直接进样法(有拖尾)为佳,其理论板数较难达到5000以上,根据多次色谱条件的摸索,得出甲醇的理论板数与分流比和载气流速、柱温相关,当分流比为71,载气流速为4.5MLMIN1,柱温40℃时甲醇的理论板数较高,为13000,故最终采用了这个色谱条件。3.3混合对照溶液浓度的改进原标准为分别精密称取甲醇、丙酮、甲苯适量,定量稀释成每1ML中分别含50,10,10ΜG的混合对照溶液,而根据样品的取样量、稀释倍数和残留溶剂的限度[0.02%,0.02%,0.025%(GG)],应分别稀释成每1ML中分别含50.0,50.0,62.5ΜG的混合对照溶液[3~5]。[参考文献][1]国家食品药品监督管理局.进口药品注册标准JX20050137[S].[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[Z].北京化学工业出版社,2005附录64.[3]陈立亚,于宝珠,赵慧芳.ICH指导原则与各国现行药典药品的残留溶剂分析方法概述[J].中国药事,2005,19(9)542.[4]陈赛贞,袁国平,顾艳飞.毛细管顶空进样法测定更昔洛韦中有机溶剂残留量[J].中国现代应用药学杂志,2005,22(3)238.[5]李英华,吕秀阳,吕丽丽,等.顶空气相色谱法在药物分析中的应用[J].药物分析杂志,2005,25(12)1404.动态浊度法定量测定注射用阿洛西林钠细菌内毒素含量姚治,倪维芳,朱社敏(浙江省药品检验所药理室,杭州310004)[摘要]目的应用动态浊度法鲎实验定量测定注射用阿洛西林钠中细菌内毒素含量。方法通过干扰实验确定样品检测浓度,并建立标准曲线对样品进行细菌内毒素定量测定。结果样品在1MGML1时,对鲎实验检查无干扰作用,细菌内毒素回收率在50%~200%范围内。样品中的内毒素含量可定量测定。实验结果与半定量凝胶法测定结果吻合。结论动态浊度法可用于注射用阿洛西林钠中细菌内毒素定量检测。[关键词]阿洛西林钠;细菌内毒素;动态浊度法[中图分类号]R927.1;R978[文献标识码]A[文章编号]10040781(2008)11139602注射用阿洛西林钠为国家基本医疗保险药品目录收载品种,其侧链部分添加的咪唑环结构使其抗菌范围更广、抗菌活性更强,尤其是抗铜绿假单胞菌活性更强,且增加了Β内酰胺酶对Β内酰胺环作用的空间位阻,使其对Β内酰胺酶更稳定。主要用于敏感的革兰阳性菌及阴性菌所致的各种感染以及铜绿假单胞菌感染,包括败血症、脑膜炎、心内膜炎、化脓性胸膜炎、腹膜炎及下呼吸道、胃肠道、胆道、泌尿道、骨及软组织和生殖器官等感染,妇科、产科感染,恶性外耳炎、烧伤、皮肤病及手术感染等。笔者在本实验中参照中华人民共和国药典2005年版[1]细菌内毒素动态浊度法,对注射用阿洛西林钠细菌内毒素定量检测进行研究,同时进行凝胶半定量法比对。1仪器与试药BET32B细菌内毒素定量检查仪(天津大学无线电厂);SANYO恒温培养箱。注射用阿洛西林钠(本所检验留样样品,批号060619,060626,060627),规格1.0G;细菌内毒素标准品(中国药品生物制品检定所提供,批号200510,规格每支100EU);动态比浊法鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司提供,批号0609271,灵敏度0.03EUML1,规格1.2ML);凝胶法鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司提供,批号0708241,灵敏度0.03EUML1);细菌内毒素检查用水(BET水,批号0707170,规格100ML)。[收稿日期]20080111[作者简介]姚治(1967-),男,浙江杭州人,副主任药师,学士,主要从事药品检验工作。电话0571-86458914,(0)13705817389,EMAILYAOZHI_1118@126.COM。2方法与结果2.1细菌内毒素限值(L)的确定注射用阿洛西林钠的临床最大用量(M)为4000MG(60KG)1H1,静脉给药制剂最大可接受的内毒素量(K)为5.0EUKG-1H1,L=K/M=5.0EUKG-1H1/4000MG(60KG)1H1=0.075EUMG1,确定本品的限值为0.075EUMG1。2.2供试品的制备及最大可稀释倍数(MVD)的确定供试品用10MLBET水复溶,初始浓度(C)为100MGML1,限值L为0.075EUMG1,标准曲线最低浓度Λ1为0.03125EUML1,供试品的最大可稀释倍数(MVD)=LC/Λ1=0.075EUMG1100MGML1/0.03125EUML1=240倍。2.3细菌内毒素标准曲线的建立与可靠性实验用BET水将细菌内毒素标准品进行稀释,使其最终细菌内毒素浓度分别为0.50000,0.25000,0.12500,0.06250,0.03125EUML1,各取0.2ML分别加到预先加有0.1ML动态比浊法鲎试剂的反应管内,混合均匀,插入BET328型细菌内毒素检测系统内进行自动检测,其中每一浓度重复3管。标准曲线回归方程为LOGT=2.7291-0.2383LOGC,相关系数R=-0.993(绝对值应>0.98),平行管之间的RSD均<10%,空白对照管在规定检测时间外,故细菌内毒素标准曲线成立。结果见表1。2.4干扰实验取批号为060619的样品,用BET水10ML复溶,再进一步稀释成30,60,120,240倍稀释液,记为AI稀释液;同时另取4管进行同样倍数的稀释,并在稀释液中添加内毒素,使各稀释液中的内毒素含量均为0.125EUML1,记为BI6931HERALDOFMEDICINEVOL27NO11NOVEMBER2008稀释液,进行回收率实验。分别取上述各液0.2ML,加到预先加有0.1ML动态比浊法鲎试剂的反应管内,混合均匀,插入仪器内进行测定,每个浓度重复2管。同步作标准曲线,并根据标准曲线计算各被测液中的内毒素含量,计算回收率,结果见表2。结果显示,样品30,60,120,240的回收率均在50%~200%,符合要求。其中60,120和240倍稀释液的回收率相对较好。表1细菌内毒素标准曲线及可靠性N=3内毒素浓度(C)/(EUML1)平均反应时间(T)/SRSD/%阴性对照<36000.5639.30.860.25741.00.360.125851.00.540.06251001.72.560.031251232.31.11表2干扰实验结果稀释倍数AI/(EUML1)BI/(EUML1)回收率/%300.11060.189963.4600.07240.2084108.81200.04290.1925119.72400.01860.1716122.42.5供试品的动态浊度法定量检测取3批样品,分别先用10MLBET水复溶,再进行120倍稀释。并同时制备样品阳性对照PPC(添加内毒素使成含外加内毒素0.125EUML1)和标准曲线各浓度系列。分别取上述各液0.2ML,加到预先加有0.1MLTAL的反应管内,混合均匀,插入仪器内进行测定,每个浓度重复3管。根据标准曲线计算回收率和样品的内毒素含量。结果见表3。表3显示,样品120稀释液的外加内毒素回收率在50%~200%范围内,可进行定量测定,检测结果均小于限度0.075EUMG1,其中批号为060619的样品含量接近边缘。表3样品动态浊度法定量检测结果批号平均反应时间(T)/S内毒素浓度(C)/(EUML1)RSD/%回收率/%稀释倍数内毒素含量/(EUMG1)06061911180.0544.321200.052PPC7850.1951.81112.906062620740.0032.771200.004PPC8200.1620.24127.206062713250.0213.121200.025PPC8030.1782.90125.5标准曲线LOGT=2.7292-0.2328LOGC,R=-0.9932.6供试品的凝胶法半定量检测取3批样品,分别先用10MLBET水复溶,再作60,120,240倍稀释。并同时制备样品阳性对照PPC(添加内毒素使成含外加内毒素0.06EUML1)。分别取上述各液0.1ML,加到预先加有0.1ML凝胶法鲎试剂的反应管内,每个浓度作2管,混合均匀,置于(37.02.0)℃培养1H,同时作阳性对照和阴性对照各2管,结果见表4。结果显示,各浓度系列PPC管均为阳性,实验成立,半定量的推算结果表明批号为060619的样品为边缘产品,含量接近限度,其次为060626,060627含量最低,上述结果与定量法有一定的相关性。表4样品凝胶法半定量检测结果批号稀释倍数60120240内毒素浓度(C)/(EUML1)内毒素含量/(EUMG1060619++++--3.6~7.20.036~0.072PPC++++++060626++----1.8~3.60.018~0.036PPC++++++060627------<1.8<0.018PPC++++++“++”表示阳性,“--”表示阴性3讨论目前在我国的药品检验领域,用鲎实验法替代家兔法来检测产品中的细菌内毒素已经十分广泛和成熟。但目前所使用的方法多为凝胶法的限值法,结果只能判断产品的内毒素含量是否超标,而无法给出准确的含量。而采用定量法(有动态浊度法、终点比色法等),则可以相对准确的了解产品中真实的内毒素含量。由于该法较凝胶法更为快速、准确,在成品检验、中间体控制、工艺筛选等方面有更大的优势。比如本实验所测定的3批样品,若用常用的凝胶法检测,则均为合格产品。而从定量法的结果看,3批产品的质量在合格的前提下是有明显的区别,这种检测手段可提升企业在GMP生产和质量控制的有效性、准确性,具有推广的使用价值[2,3]。实验结果表明,用动态浊度法来定量检测注射用阿洛西林钠中的细菌内毒素的实际含量可行。样品对本法基本无干扰作用。该法可有效用于产品的日常检验和过程控制。[参考文献][1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[Z].北京化学工业出版社,2005附录85-88.[2]丁水平,杜光,李永进.注射用硫酸头孢匹罗的细菌内毒素定量检测[J].医药导报,2007,26(4)420-422.[3]陈久艳.动态浊度法检测注射用头孢替安中细菌内毒素的含量[J].抗感染药学,2006,3(3)107-109.7931医药导报2008年11月第27卷第11期

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