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Bax抑制肽对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞保护作用

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Bax抑制肽对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞保护作用

Bax一抑制肽对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞保护作用摘要目的通过检测应用gax一抑制肽对新生鼠缺血缺氧性脑损伤后神经细胞凋亡的疗效,探讨Bax一抑制肽对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用。方法选取200只7日龄新生wjster大鼠为研究对象,随机分为以下三组假手术组对照组实验组bax一抑制肽。对照组与实验组分别通过结扎左侧颈总动脉以及置于8%的氮氧混合气中2小时建立新生鼠缺氧缺血性脑损伤HIBD模型,假手术组仅游离左侧颈总动脉,不结扎,不低氧处理。实验组于建立模型后0h、6h、12h、24h、48h、3d不同时问点侧脑室注射bax抑制肽5ug5u1,其余两组予相同剂量生理盐水于相同时间点侧脑室注射。对照组和假手术组于HIBD模型建立后第12h、24h、2d、3d、7d及实验组HIBD后第7d每组取2只甲醛灌注后断头取脑海马组织病理检测,另取6只新鲜脑组织进行蛋白免疫印迹法Westonblot检测活性Caspase一3蛋白、逆转录PCRRTPCR测定Caspase3mRNA的表达。结果l、HE染色组织显示在患侧海马区,实验组及对照组oh、6h、12h、24h、48h各亚组均有病理性损伤,实验组病理损伤程度低于对照组,在72h亚组实验组与对照组病理损伤无明显差异。2、Westernblot检测Caspase一3蛋白及RTPCR检测Caspase一3mRNA对照组与假手术组比较,对照组在HIBD后oh、6h、12h、24h海马区Caspase一3及mRNA依次增多,24h达高峰,48h开始下降,7d时达到基础水平。3、HIBD后7dWesternblot检测Caspase3实验组与对照组在0h、6h、12h、24h、48h各亚组比较,海马区Caspase一3明显减少,差异有统计学意义在72h亚组比较差异无统计学意义。实验组各亚组间比较,HIBD后越早注射bax一抑制肽,Caspase一3越少,差异有统计学意义。4、HIBD后7dRTPeR检测Caspase一3mRNA实验组和对照组在0h、6h、12h、24h、48h各亚组比较,患侧海马区活性Caspase一3明显减少,差异有统计学意义在72h亚组比较差异无统计学意义。实验组各亚组间比较,HIBD后越早注射bax一抑制肽,Caspase一3mRNA量越少,差异有统计学意义。结论1、新生大鼠缺氧缺血脑组织Caspase一3及mRNA表达增多,神经细胞凋亡增加,24小时达高峰,48小时后逐渐下降。2、HIBD后2天内侧脑室注射bax一抑制肽可减少Caspase一3及mRNA的表达,减轻神经细胞凋亡。3、在HIBD后越早给予bax抑制剂治疗,神经保护作用越明显,缺氧缺血后2天内为有效治疗时间窗。硕士研究生张辉儿科学专业指导教师姜红教授关键词bax抑制肽缺氧缺血脑新生儿Caspase一3NeuroprotectiVeEffectofBaxInhibitingPeptideonNewbronRatswithNeonatalHypoxicIschemicDamageAbstractobjectiveToinvestigatetheeffectsofBaxinhibitorypeptideonimprovingneuronalapoptosisinnewbornratswithhypoxiaischemicbraindamageHIBD.MethodTwohundred7dayoldnewbornwisterratswererandomlydividedintothreegroupsShamoperationgroup,controlgroup,experimentgroup.HIEmodelwasestablishedbyligationoftheleftcarotidarteryalongwith2h8%oxygenexposureinneonatalratsofthecontrolandexperimentgroups.Theshamoperationgroupwasnotsubjectedtohypoxiaischemia.111eexperimentgroupreceivedanintracerebroventricularinjectionofbaxinhibitorypeptidewithdoseof5ug5u1respectivelyinoh,6h,12h,24h,48hand3dafterHIBD,whiletheothertwogroupsreceivednormalsalineatthesametime.Eachgroupofmiceweresacrificed,onthe12h,24h,48h,3dand7dafterHIBD,taketwomiceineachsubgroupafterperfusionwithformaldehydeandbrainswereremovedforhippocampalpathologydetectionbyHEstaining,whiletakesixmiceineachsubgroupthebrainswereremovedforcaspase3detectionbyWesternblotandmRNAdetectionbyreversetranscriptionPCR.Result1.ByHEstaining,theexperimentalandcontrolgroupwerepathologicallesion,thedegreeofdamageoftheexperimentgroupdecreasedcomparedwiththecontrolgroupinOh、6h、12h、24hand48hsubgroups,andtherewasnovariousdifferenceinpathologicaldamagebetweentheexperimentgroupandthecontrolgroup.2.Theexpressionofcaspase3proteinbyWestemblotandCaspase3mRNAbyreversetranscriptionPCRdetectionafterHIBDthecontrolgroupcomparedwitlltheshamgroup.caspase3andmRNAexpressiongraduallyincreasedinoh,6h,12h,24hafterHIBD,reachedapeakof24hours,48hoursdecreased,basiclevelreachedin7d.3.Theexpressionofcaspase一3proteinbyWesternblotdetection7dafterHIBDtherewassignificantdifferencebetweentheexperimentalgroupandcontrolgrouptheateachtimepoint0h,6h,12h,24h,48hafterHtBDThedifferencesbetweenthevarioussubgroupsoftheexperimentalgroupwasstatisticallysignificant0h,6h,12h,24h,48h,72hafterHIBD.4.Theexpressionofcaspase一3mRNAbyreversetranscriptionPCRdetection7dafterHIBDTherewassignificantdifferencebetweentheexperimentalgroupandcontrolgrouptheateachtimepoint0h,6h,12h,24h,48hafterHIBDThedifferencesbetweenthevarioussubgroupsoftheexperimentalgroupwasstatisticallysignificant0h,6h,12h,24h,48h,72hafterHIBD.Conclusion1.Activecaspase一3andmRNAexpressionincreasedafterHIBD.reachedapeakof24hours,48hoursdecreased.2.Theintracerebroventricularinjectionbaxinhibitorypeptidereducestheexpressionofactivecaspase一3andmRNA,alleviatedneuronalapoptosis.3.Baxinhibitortherapysoonertheyaregiven,thebetter,andtwodaysafterHIBDasavalidtherapeuticwindow.PostgraduatestudentZHANGHuiPediatricsDirectiedbyProLJIANGHongKeywordsBaxinhibitorpeptideHypoxiaischemieBrainNewbronCaspase一3目录引言1第i章材料与方法31.1材料3i.1.1实验动物31.1.2实验药品和试剂31.i.3主要实验仪器及设备3i.2.方法41.2.1实验动物的分组与处理41.2.2标本采集51.2.3制备脑组织切片及HE染色一51.2.4Westernblot检测Caspase一3蛋白61.2.5RT~PCR检测Caspase一3mRNA一7第2章数据采集及处理92.1数据采集92.2统计学处理9第3章结果l03.1HIBD模型的建立103.2新生大鼠脑组织病理103.3Westernblot检测Caspase一3表达103.4RTPCR检测Caspase一3mRNA表达ll第4章讨论l3第5章结论I8附图表19参考文献22综述26攻读学位期间的研究成果35致谢36学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声青岛大学硕士学位论文引言新生儿缺氧缺血性脑损伤Hypoxicischemicbraindamage,HIBD是由于围产期缺氧窒息等因素,导致新生儿脑组织的缺氧缺血性损害,包括一系列神经性的病理生理改变以及临床上出现一系列脑病的表现。脑缺氧后发生一系列病理生理过程瀑布式发生,多种发病机制交互作用,逐渐导致不可逆性脑损伤。线粒体功能障碍在缺氧缺血性脑损伤发生过程中起关键性的作用,线粒体是氧化磷酸化生成能量的重要部位,对缺氧非常敏感。缺氧缺血可能通过各种途径影响线粒体膜通透性转运孔的功能,引起线粒体通透性转变,导致细胞坏死和或凋亡。IIIBD过程中神经细胞损伤主要表现为坏死和凋亡,而凋亡引起的损伤更严重、更持久,且在HIBD的发病机制中占主导地位n。脑缺氧缺血引发了一些有害的活动兴奋性氨基酸释放,细胞内钙增加,一氧化氮等活性氧的积累,失去营养因子的支持,并诱导的cJun蛋白激酶口1。在一定的阈值水平,这些上游的压力打乱了Bcl一2家族促凋亡与抗凋亡因子的的平衡,导致线粒体外膜的通透性增加H3。线粒体通透性增加,细胞色素C细胞色素C和凋亡诱导因子apoptosisinducingfactor,AIF被释放,从而激活半胱天冬酶caspase依赖性和半胱天冬酶非依赖性的细胞凋亡阻3。凋亡发生是一个由caspase家族成员介导的蛋白酶级联瀑布反应过程,一旦效应caspase被激活,便大范围的水解细胞内的靶物质,从而降解细胞内蛋白,最终使细胞不可逆的走向死亡。在多种因子的刺激下,线粒体释放细胞色素C,ApafI与细胞色素C构成复合体,激活caspase9,引起级联瀑布式反应,进一步激活下游的caspase3,6,7等,最终导致细胞凋亡拍1研究事实证明,通过结合抑制AIF和半胱天冬酶,能够明显减轻脑损伤,从而推断,如果能在脑缺氧缺血后改善线粒体通透性,可能会提供一条保护未成熟脑新途径哺1。目前的研究认为至少有两条通路可导致线粒体通透性增加一种是存在于线粒体内膜的渗透性转换孔的开放PIP,依赖亲环素D调节,可被亲环素D1约配体环孢素A所阻遏。第二条是Bax通道,它位于线粒体外膜上,线粒体外膜通道通透性的选择性增加具有更重要意义。根据WangX。的实验推断抑制线粒体PTP通道在未成熟脑中不能起到脑保护的作用。Bax在未成熟脑中呈高表达隋1,在线粒体通透性调节中起关键作用,而随着大脑发育在成熟脑中Bax表达水平降低。未成熟脑缺氧缺血后Bax从细胞质转位到线粒体,使线粒体膜腔隙中的促凋亡蛋白释放,而Bax基因敲除小鼠对缺氧缺血后脑损伤有保护作用一1。因此,我们的假设是药物抑制Bax转位或者激活可能是保护未成熟脑的一条有效策略。Caspase家族是细胞凋亡过程中一类关键的同源半胱氨酸蛋白酶,能特异性的在天冬氨酸残基后裂解靶蛋白,其中caspase一3属于效应亚类的caspase。正常生引言理情况下,caspase家族在细胞中以无活性的酶原形式存在。当细胞发生缺氧缺血性损伤时,多种因子均可激活caspase家族,之后发生与细胞凋亡有关的瀑布式级联反应,最终都通过caspase一3的活化执行凋亡过程,caspase一3被认为是细胞凋亡的最终执行者01,其变化在神经细胞凋亡过程中发挥重要作用¨。发生细胞凋亡时,激活32KD的caspase一3裂解为12KD和17KD的活性片段,再特异性切割其相对应的底物,最终导致细胞凋亡n。在新生鼠HIBD模型的试验中,侧脑室给予caspase抑制剂可减轻细胞凋亡1所以caspase一3可作为细胞凋亡的重要检测指标。本研究以新生大鼠缺氧缺血性脑损伤为模型,通过抑制线粒体膜通透性转变MPT激活的第二条途一Bax途径在新生大鼠于侧脑室给予Bax一抑制肽后不同时间点对脑组织病理、神经细胞凋亡及Caspase一3蛋白和mRNA进行检测,及脑损伤后神经功能、行为学检测评价脑损伤。通过进一步进行统计学分析,以评价Bax抑制肽线粒体保护作用防治新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞凋亡的疗效,有望为新生儿缺氧缺血性脑病的临床治疗提供一种新的药物途径。2材料与方法第一章材料与方法1.1材料1.1.1实验动物新生7日龄Wister大鼠SCXK鲁20090007,雌雄不限,体质量12169,共200只,由青岛市实验动物和动物实验中心提供。1.1.2实验药品和试剂1活化半胱胺酸蛋白酶蛋白一3抗体产品编号BS一0081R英文名称AntiCaspase3Active生产商名北京博奥森生物技术有限公司2Bax抑制肽英文名称BaxInhibitingPeptide,V5产品批号196810生产商名德国默克医药公司产品规格5mg/mL3高灵敏度化学发光检测试剂盒产品货号CW0049生产商名北京康为世纪生物科技有限公司4RTPCR试剂盒RNA提取、逆转录、扩增产品名称TRIzol试剂,逆转录试剂盒,TaqDNA聚合酶,dNTP生产商名美国MBI公司5自备试剂及用品手术器械载玻片及盖玻片防脱片用多聚赖氨酸0.2mol/L磷酸氢二钠储存液500ml蒸馏水加Na。HPO。12H。035.819O.2mol/L磷酸二氢钠储存液500ml蒸馏水加NaH。P0。2H015.6090.2mol/L磷酸缓冲液pH7.64%中性缓冲多聚甲醛固定液40%甲醛与0.01MPBS之比为l9配制10%水合氯醛溶液8%氮氧混合气体青岛华瑞气体科技有限公司1.1.3主要实验仪器及设备1显微镜及显微成像系统OLYMPUSBX412微量注射器10u1上海医用仪器厂3青岛大学硕士学位论文3脑/组织切片机Leika22354蛋白电泳系统BioRadMiniPR。TE州rretraII5蛋白转膜系统北京六一DYY一7C型6化学发光成像系统FusionX7型7常压缺氧舱装置自制图18PCR热循环仪美国PE公司,GeneAmpPCRsystem2400型。9紫外分光光度计美国Beckman公司。10凝胶成像系统ImageMasterVDS美国PharmaciaBiotech公司。1.2方法1.2.1实验动物的分组与处理1动物分组新生7日龄Wister大鼠,雌雄不限,体质量12169图2,随机分为三组,分别为假手术组对照组生理盐水组实验组bax一抑制肽组。假手术组和对照组根据解剖时间分为12h、24h、48h、48h、3d、7d五个亚组。实验治疗组根据bax一注射时间的不同分为HIBD后即可、6h、12h、24h、48h、3d六个亚组。模型制作过程、侧脑室穿刺过程及后期喂养过程中共死亡15只,按随机原则以经过相同处理的动物补充。2新生大鼠HIBD模型制作参照Rice法【】制作HIBD模型选择新生7日龄Wister大鼠按体质量给予10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉后,仰卧位,四肢和头部固定于手术板上用安尔碘局部消毒颈部皮肤。于颈部正中作一长约0.6cm切口,暴露于气管平行的胸骨舌骨肌及肩胛舌骨肌和胸锁乳突肌将胸骨舌骨肌和肩胛舌骨肌分离,沿胸骨舌骨肌做分离,暴露并游离左侧颈总动脉图3。双线结扎左侧颈总动脉,一次性40号缝合线缝合切口手术时间小于10分钟。术后放回母鼠身边恢复2小时待术后苏醒将新生鼠放入3000ml透明密闭容器,以2L/min的速度向透明密闭容器内输入经由湿化处理8%氮氧混合气体,密闭容器置于37。C恒温水浴箱中缺氧2小时后,取出大鼠放回母鼠身边喂养,避免强光和噪音刺激。建立新生鼠缺血缺氧性脑损伤模型成功的指标有新生鼠术后感觉神经功能障碍、体重增长缓慢、病变侧脑组织与正常脑组织比较,在形态上以及组织病理上有明显差异。新生鼠在缺氧20分钟左右出现烦躁、紫绀、呼吸急促30分钟左右出现站立不稳、抽搐l小时左右出现嗜睡、昏迷等状态。缺血缺氧性脑损伤可以导致大脑皮层下运动中枢损害,本实验约有65%的新生鼠于模型建立后出现自发左旋4材料与方法或夹尾左旋,是缺血缺氧性脑损伤模型制备成功的行为学特征,进一步证实实验模型建立成功。3实验动物的干预处理①各组动物处理假手术组仅分离左侧颈总动脉,不予结扎及缺氧处理。实验组应用bax.抑制肽5ug5u1于HIBD模型建立后即刻、6h、12h、24h、48h、3d予新生鼠侧脑室注射一次。对照组与实验组于相同时间点,予相同剂量的生理盐水侧脑室注射。侧脑室穿刺注射参照YuCheng法,在预实验中用美兰示踪,径反复解剖观察,确定方法可行,将缺氧缺血结束后2小时的大鼠俯卧位固定在手术台上,剪开头皮,暴露人字缝尖,以圆规直尺定位。定位部位为人字缝尖向嘴侧2.0mm,左侧1.5mm用10ul微量进样器自颅骨表面垂直进针2.0mm于各时间点分别注入bax一抑制肽5u1,对照组注射等量生理盐水,时间约为1分钟,注射完毕后留针30秒缓缓退出,缝合头皮后,用青霉素棉球消毒皮肤。将动物放回母鼠身边继续喂养。②假手术组和对照组在HIBD后12h、24h、48h、3d、7d五个时间点断头取脑实验治疗组和对照组在HIBD后7天断头取脑。1.2.2标本采集假手术组和对照组大鼠于分别于HIBD术后12h、24h、48h、3d、7d五个时间点各取两只,实验治疗组于HIBD后7天,各亚组取两只腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,固定于手术板上。剪断胸骨,暴露心脏。用5ml注射器刺入左心室,穿刺针进入主动脉后,用丝线结扎固定。缓慢推注4%多聚甲醛,同时剪开右心房,可见血液自右心房流出,至心房流出清亮液体,停止灌注。此时可观察到肢体末端苍白、僵硬,提示灌注良好。断头逐层剥离皮肤组织暴露颅骨,沿颅骨缝除去骨片,暴露完整脑组织。灌注良好的脑组织外观成形,脑皮质无血色。剥离完整脑组织,置于4%多聚甲醛容器中室温固定24小时。1.2.3制备脑组织切片1新鲜标本于10%福尔马林液固定24小时后,取约卜2cm2大小,厚O.20.3Oil的组织块,流水冲洗12小时。2组织脱水、渗透与包埋①脱水50%乙醇一70%乙醇85%乙醇一95%乙醇每步90min,无水乙醇260min②透明乙醇二甲苯11一二甲苯一二甲苯,每步60min③渗透二甲苯石蜡1190min一石蜡I120min一石蜡II120min,温度不

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