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Bax抑制肽对缺氧缺血脑损伤新生鼠抑制神经细胞凋亡的作用

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Bax抑制肽对缺氧缺血脑损伤新生鼠抑制神经细胞凋亡的作用

BAX抑制肽对缺氧缺血脑损伤新生鼠抑制神经细胞凋亡的作用摘要目的;通过检测脑组织内凋亡阳性神经细胞数目及CASPASE3蛋白量,探讨BAX抑制肽对缺氧缺血脑损伤新生鼠抑制神经细胞凋亡的作用及有效治疗时问窗。方法选取7日龄WISTER新生大鼠182只做为研究对象,随机分为假手术组N14、对照组N84和实验组N84。对照组与实验组通过结扎左侧颈总动脉以及置于8%的氮氧混合气中2小时建立缺氧缺血性脑损伤HYPOXIAISCHEMICBRAINDAMAGE,HIBD模型,假手术组仅游离左侧颈总动脉,不结扎不低氧处理。实验组和对照组分别经左侧侧脑室注射5UGBAX一抑制肽5U1和生理盐水5U1。根据HIBD模型建立后注射BAX抑制肽和生理盐水的时间不同,将实验组和对照组分为OH、6H、12H、24H、48H、72H六个亚组N14。假手术组不注射任何药物。所有实验动物均于HIBD模型建立后7天处死,进行脑组织病理检测、TUNEL法检测凋亡阳性神经细胞数目、蛋白免疫印迹法检测CASPASE3蛋白含量。结果①左侧海马区脑组织HE染色与假手术组比较,实验组和对照组脑组织病理损伤明显。实验组与对照组在0H、6H、12H、24H、48H亚组比较,病理损伤程度较轻,在72H亚组比较无明显差异。TUNEL染色左侧海马区脑组织凋亡阳性神经细胞数目实验组与对照组在OH、6H、12H、24H、48H各亚组比较,凋亡阳性神经细胞数目明显减少,差异有统计学意义在72H亚组比较无统计学差异。实验组的各亚组之间依次比较,TTBD模型后越早注射BAX抑制肽,凋亡阳性神经细胞数日越少,且差异有统计学意义。③蛋白免疫印迹法检测左侧海马区脑组织CASPASE~3蛋白含量实验组和对照组在0H、’6H、12H、24H、48H各亚组比较,CASPASE一3含量明显减少,差异有统计学意义;在72H亚组比较无统计学差异。实验组各亚组之间依次比较,HIBD模型后越早注射BAX抑制肽,脑组织内CASPASE一3含量越少,差异有统计学意义。结论;①新生鼠缺氧缺血脑损伤后海马区脑组织内凋亡阳性神经细胞数目和CASPASE3蛋白含量均明显增加;②BAX抑制肽可明显减少缺氧缺血脑损伤新生鼠脑组织凋亡阳性神经细胞数目和降低CASPASE一3蛋白含量,可掷制缺氧缺血后脑组织神经细胞凋亡;③缺氧缺血后48小时内是BAX抑制肽治疗缺氧缺血脑损伤的有效治疗时问窗,且越早应用治疗效果越好。硕士研究生崔凯洁儿科学专业指导教师姜红教授\I帆舯4棚哪眦帅Ⅲ11111LII哪Y2338664关键词缺氧缺血,脑;BAX抑制肽;抑制凋亡;新生鼠THEEFFECTOFBAXINHIBITORONANTIAPOPTOSISINNEURALCELLSOFNEONATALRATSWITHHYPOXIAISCHEMIABRAININJURYABSTRACTOBJECTIVETOEXPLORETHEEFFECTANDEFFECTIVETREATMENTTIMEWINDOWOFBAXINHIBITORONANTIAPOPTOSISINNEURALCELLSOFNEONATALRATSWITHHYPOXIAISCHEMIABRAININJURYBYDETECTINGTHEAPOPTOSISCELLNUMBERANDTHECASPASE一3CONTENTOFBRAINTISSUE.METHOD1827DAYOLDNEWBORNSDRATSWERERANDOMLYDIVIDEDINTOTHREEGROUPSSHAMOPERATIONGROUPN214,CONTROLGROUPN84ANDEXPERIMENTGROUPN284.HIBDMODELSWEREESTABLISHEDBYLIGATIONOFTHELEFTCAROTIDARTERYALONGWITH8%OXYGENEXPOSUREFOR2HOURINNEONATALRATSOFTHECONTROLANDEXPERIMENTGROUPS.THESHAMOPERATIONGROUPWASNOTSUBJECTEDTOHYPOXIAISCHEMIA.THENEWBOMRATSOFEXPERIMENTANDCONTROLGROUPSWERESEPARATELYINJECTEDBAXINHIBITOR5UGANDNORMALSALINE5U1THROUGHTHELEFTLAERALVENTRICULAR,BOTHEXPERIMENTANDCONTROLGROUPSWEREDIVIDEDINTOSIXSUBGROUPSSUCH嬲OH,6H,12H,24H,48HAND72HSUBGROUPSN14ACCORDINGTOTHETIMEWHENBAXINHIBITORWASGIVENAFTERTHEESTABLISHMENTOFHIBDMODEL.THESHAMOPERATIONGROUPWASGIVENNODRUGS.ALLNEWBORNRATSINTHISSTUDYWEREEXECUTEDAT7DAYSAFTERHIBDMODELESTABLISHMENT.111EBRAINTISSUEWASUSEDTODETECTPATHOLOGICALBYHESTAINING,APOPTOSISNEURALCELLNUMBERBYTUNELMETHODANDCASPASE一3BYWESTEMBLOTDETECTION.RESULT1.BYHESTAINING,THEDEGREEOFDAMAGEINTHEHIPPOCAMPALREGIONOFTHEEXPERIMENTGROUPDECREASEDCOMPAREDWITHTHECONTROLGROUPINOH、6H、12H、24HAND48HSUBGROUPS,APOPTOTICANDNECROTICCELLSCANBESEEN,ANDTHEREWASNOOBVIOUSDIFFERENCEINPATHOLOGICALDAMAGEIN72HSUBGROUPBETWEENTHEEXPERIMENTGROUPANDTHECONTROLGROUP.2.TUNELSTAININGPOSITIVECELLSNUMBERTHEDIFFERERCESOFTHEPOSITIVECELLNUMBERBETWEENTHEEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPHADSTATISTICALLYSIGNIFICANCEAT0H,6H,12K24H,48HAFTERH1BD.THEDIFFERENCEIN72HSUBGROUPBETWEENEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPHADNOSTATISTICALLYSIGNIFICANCE.THEDIFFERENCESAMONGOH,6LL,12H,24HAND48HINTHEEXPERIMENTALGROUPWERESTATISTICALLYSIGNIFICANT.THEREWERENOSTATISTICALLYSIGNIFICANTDIFFERENCESAMONGEACHSUBGROUPINTHECONTROLGROUP.3.CONTENTOFCASPASEPROTEINBYWESTERNBLOTDETECTIONTHEREWASSIGNIFICANTDIFFERENCEBETWEENTHEEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPTHEATEACHTIMEPOINTOH,611,12K24H,48HAFTERHIBD;THEDIFFERENCESBETWEENTHEVARIOUSSUBGROUPSOFTHEEXPERIMENTALGROUPWASSTATISTICALLYSIGNIFICANT0H,6H,12H,24H,48H,72HAFTERHLBD;THEREWASNOSTATISTICALLYSIGNIFICANTDIFFERENCECOMPAREBETWEENEACHPOINTTIMEINTHECONTROLGROUP.CONCLUSION1.THENUMBEROFAPOPTOSISCELLSANDTHECONTENTOFCASPASE3WEREINCREASEDSIGNIFICANTLYAFTERHIBDMODELS.2.THEINTRACEREBROVENTRICULARINJECTIONBAXINHIBITORYPEPTIDEREDUCESTHEEXPRESSIONOFACTIVECASPASE3ANDALLEVIATENEURONALAPOPTOSIS3.THEEFFECTIVETREATMENTTIMEWINDOWOFBAXINHIBITORINHYPOXIAISCHEMIATIMEISWITHIN48HAFTERHIBD.THESOONERTHEBAXINHIBITORISGIVEN,THEBETTERTHEBAXINHIBITORCURETHEHYPOXICISCHEMICBRAININJURYOFNEWBORNMOUSE.POSTGRADUATESTUDENTCUIKAIJIEPEDIATRICSDIRECTIEDBYPROF.JIANGHONGKEYWORDSHYPOXIAISCHEMIC,BRAIN;BAXINHIBITORPEPTIDE;ANTIAPOPTOSIS;NEONATALRATS.目录弓I言.1第1章材料与方法31.1材料...31.1.1实验动物.....31.1.2实验药品和试剂.3L1.3主要实验仪器及设备41.2.方法41.2.1实验动物的分组与处理.41.2.2标本采集.51.2.3制备脑组织切片51.2.411E染色61.2.5TUNEL染色.61.2.6WESTERNBLOT检测..7第2章2.12.2数据采集及处理一...一M一一一8数据采集一8统计学处理.8第3章结果MM一......93.1新生鼠缺血缺氧性脑损伤H1BD模型建立93.2新生大鼠脑组织HE染色病理改变93.3TUNEL染色检测凋亡阳性神经细胞数目93.4WESTERNBLOT检测CASPASE3蛋白量LO第4章讨论......一............M.12第5章结论一...16附图表...一M一.............17参考文献一...M................20综杰楚””‘.。””...23攻读学位期间的研究成果...一......M一..23致谢...一..........................34学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明引言引言新生几缺氧缺血性脑病HYPOXICISCHEMICEHCEPHALOPATHY,HIE是新生儿时期的严重疾病之一,是新生儿死亡、继发脑瘫和智力障碍的重要原因。在我国,新生LHIE的发生率约为活产儿的3‰一6‰,其中15%一20%在新生儿期死亡,存活者中25%一30%可能留有不同类型和程度的远期后遗症,重度HIE患儿预后不良率高达73.16%,成为危害我国儿童生活质量的重要疾病之一N1。目前临床上采用的治疗新生LHIE的方法有多种。例如,从整体出发重视全局观念的“三对症三支持”治疗、高压氧治疗、亚低温治疗、各种神经营养因子等。但这些治疗方法疗效并不理想,由于新生LHIE高的发病率及神经致残率,寻找一个安全有效的方法对于新生LHE的治疗显的尤为重要和迫切,也是围生期工作者一直以来努力的方向。在循证医学大当其道的今天的现代医学,了解疾病的发病机制,根据其发病机制来寻找相应的治疗措施无疑是科学有效的方法之一。因此,了解新生儿缺氧缺血后神经细胞死亡的发生机制是寻我有特异疗效的治疗新生儿缺氧缺血性脑病的可行方法之一。一直以来,有关缺氧缺血后神经细胞死亡机制的研究曾未间断,研究者们对缺氧缺血后神经细胞死亡机制的认识,从最早期的以细胞坏死为主陪引,随后的以细胞凋亡为主巧1,直至现在开始出现在文献当中的“细胞凋亡一坏死连续体”蚓。新生儿缺氧缺血后神经细胞死亡机制研究的逐渐深入,也开始让更多的学者们将眼光投向如何早期中断神经细胞死亡的研究。因此,早期中断神经细胞死亡,减轻脑损伤及后遗症的发生,是近年来新生儿HIE的研究热点。缺氧缺血后新生儿脑损伤的发生机制非常复杂的,远比我们在动物实验中所发现的要复杂的多。缺氧缺血后继发的能量代谢障碍触发了许多病理生理反应,但是这些病理生理反应在线粒体水平有一个共同的交集。许多研究表明线粒体损伤可能是神经细胞缺氧损伤的中心环节,其中,线粒体膜通透性的改变是线粒体相关的凋亡诱导途径的关键步骤。线粒体膜通透性改变后,存在于内外膜间隙内的细胞色素C释放至胞浆中,激活CASPASE蛋白家族成员介导蛋白酶级联反应。目前认为,细胞中CASPASE一经活化,凋亡即不可避免口1。至目前为止,CASPASES已发现14种,其中CASPASE3被认为是CASPASE级联反应中最关键的效应蛋白酶,其靶蛋白包括许多维持细胞内环境稳定的必需结构、代谢和修复的蛋白。CASPASE一3受到该家族成员以及其他蛋白酶激活后酶解切割其特异性底物,使底物结构改变或影响特定的信号分子而参与细胞凋亡的实施过程。无论任何途径激活的细胞凋亡最终都需要通过CASPASE3完成,可以说CASPASE3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的最终通路。线粒体膜通透性转变可被多种因素激活,其中研究比较透彻的主要有两个途径阳州1.线粒体膜通透性转移孔道膜间孔,PT孔道的开放~环孢菌素A依赖途青岛大学硕JB学位论文径,也被称为PT孔道途径。线粒体膜通透性孔道能被多种病理因素激活,激活后导致线粒体膜间隙蛋白因子释放入胞质中引起细胞凋亡。2.促凋亡蛋白一一BAX途径,如BAX等蛋白可直接与线粒体外膜上的电位依赖性阴离子孔道VDAC结合。BAX在未成熟脑中呈高表达,在线粒体通透性调节中起关键作用,而随着大脑发育在成熟脑中BAX表达水平很低。未成熟脑缺氧缺血后BAX从细胞质转位到线粒体,使线粒体膜腔隙中的促凋亡蛋白释放,而BAX基因敲除小鼠对缺氧缺血后脑损伤有保护作用【10●BAX抑制肽最初是作为一种BAX途径诱导凋亡的抑制剂而被发现的。研究已证实,BAX抑制肽在许多方面抑制凋亡的发生,例如活性氧的生产、胞质酸化和钙水平以及内质网应激信号转导通路N“。目前已有研究发现BAX抑制性多肽可以降低未成熟脑缺氧缺血后线粒体膜腔隙中的促凋亡蛋白的释放以及CASPASE级联反应的激活减轻脑损伤。本研究采用制备新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型,在模型建立后的不同时间点经左侧侧脑室穿刺注射5UG的BAX抑制肽。所有新生鼠均在模型建立后7天处死,对左侧海马区脑组织进行病理检查,TUNEL法检测凋亡阳性神经细胞数目及WESTINGBLOT检测CASPASE3含量;探讨BAX抑制肽对缺氧缺血脑损伤新生鼠神经细胞的抗凋亡作用以及有效治疗时间窗。第一章材料与方法第一章材料与方法1.1材料1.1.1实验动物新生7日龄WISTER大鼠SCXK鲁20090007,雌雄不限,体质量12169,共182只,由青岛市实验动物和动物实验中心提供。1.1.2实验药品和试剂1细胞色素C抗体产品编号BS0013R英文名称ANTICYTOCHROMEC生产商名北京博奥森生物技术有限公司2活化半胱胺酸蛋白酶蛋白一3抗体产品编号BS008IR英文名称ANTICASPASE一3ACTIVE生产商名北京博奥森生物技术有限公司3BAX一抑制肷英文名称BAXINHIBITINGPEPTIDE,V5产品批号196810生产商名德国默克医药公司产品规格5MG/ML4高灵敏度化学发光检测试剂盒产品货号CW0049生产商名北京康为世纪生物科技有限公司5细胞凋亡试剂盒英文名称ROCHETUNEL试剂盒产品货号11684817生产商名上海罗氏公司6自备试剂及用品手术器械载玻片及盖玻片防脱片用多聚赖氨酸0.2MOL/L磷酸氢二钠储存液500ML蒸馏水加NA2TTP0412H2035.8190.2MOL/L磷酸二氢钠储存液500ML蒸馏水加NAH2P042H2015.6090.2MOL/L磷酸缓冲液PH7.64%中性缓冲多聚甲醛固定液40%甲醛与0.01MPBS之比为L9配制3青岛人学硕士学位论文10%水合氯醛溶液8%氮氧混合气体青岛华瑞气体科技有限公司1.13主要实验仪器及设备1显微镜及显微成像系统2微量注射器10U13脑/组织切片机4蛋白电泳系统5蛋白转膜系统6化学发光成像系统7常压缺氧舱装置1.2方法1.2.1实验动物的分组与处理1动物分组OLYMPUSBX41上海医用仪器厂LEIKA2235BIORADMINIPROTEANTETRALI北京六一DYY7C型FUSIONX7型自制.7日一龄新生WISTER大鼠182只,雌雄不限,体质量12169,随机分为三组,即假手术组;对照组生理盐水组;实验组BAX一抑制肽组。实验组和对照组根掘侧脑室注射BAX抑制肽和生理盐水的时间分为OH、6H、12H、24H、48H、72H六个亚组。模型制作过程、侧脑室穿刺过程及后期喂养过程中共死亡12只,按随机原则由经过相同处理的动物补充。23新生大鼠HIBD模型制作.参照RICE法N明制作HIBD模型选择新生7日龄WISTER大鼠按体质量给予1096水合氯醛3ML/KG腹腔注射麻醉后,取仰卧位,四肢和头部固定于手术板上;用安尔碘局部消毒颈部皮肤。于颈部正中作一长约0.6CM切口,暴露于气管平行的胸骨舌骨肌及肩胛舌骨肌和胸锁乳突肌;将胸骨舌骨肌和肩胛舌骨肌分离,沿胸骨舌骨肌做分离,暴露并游离左侧颈总动脉见图1。双线结扎左侧颈总动脉,一次性40号缝合线缝合切口手术时间小于8分钟。术后放回母鼠身边恢复2小时;待术后苏醒将大鼠放入3000ML透明密闭容器,以2L/MIN的速度向透明密闭容器内输入经由湿化处理8%氮氧混合气体,密闭容器置于37。.C恒温水浴箱中;缺氧2小时后,取出大鼠放回母鼠身边喂养,避免强光和噪音刺激。建立新生鼠缺血缺氧性脑损伤模型成功的指标有新生鼠术后感觉神经功能障碍、体重增长缓慢、病变侧脑组织与正常脑组织比较,在形态上以及组织病理上有明显差异。新生鼠在缺氧20分钟左右出现烦躁、紫绀、呼吸急促;30分钟左右出现站立不稳、抽搐;L小时左右出现嗜睡、昏迷等状态。缺血缺氧性脑损伤可以导致大脑皮层下运动中枢损害,本实验约有6596的新生鼠于模型建立后出现自发左旋或夹尾左旋,是缺血缺氧性脑损伤模型制备成功的行为学特征,进一步证实本实验4

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