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B细胞型非霍奇金淋巴瘤CHFR基因mRNA表达与启动子区甲基化相关性研究

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B细胞型非霍奇金淋巴瘤CHFR基因mRNA表达与启动子区甲基化相关性研究

B细胞型非霍奇金淋巴瘤CHFR基因MRNA表达与启动子区甲基化相关性研究摘要目的检测B细胞型非霍奇金淋巴瘤BNHL组织中CHFR基因MRNA表达水平及其与启动子区甲基化的关系,同时探讨CHFR表达及甲基化水平与B细胞型非霍奇金淋巴瘤临床病理特征的关系。方法采用荧光定量PCR方法检测8L例B细胞型非霍奇金淋巴瘤组织和38例淋巴结反应性增生组织RH中CHFRMRNA的表达水平;采用甲基化特异性PCR方法检测BNHL组织及RH组织中CHFR基因甲基化水平。结果①81例BNHL组织中不同程度低水平表达CHFRMRNA,其中2例表达缺失,而在淋巴结反应性增生组中该基因全部表达,BNHL组CHFRMRNA相对表达量为0.210.12,对照组CHFRMRNA相对表达量为0.270.13,BNHL组明显低于对照组PO.013。81例BNHL患者中21例患者出现CHFR基因启动子区甲基化,38例RH组织中未发现CHFR基因甲基化,差异有统计学意义PO.001。BNHL组织样本中甲基化组CHFRMRNA的相对表达量为0.130.05,非甲基化组CHFRMRNA的相对表达量为0.230.12,前者明显低于后者尺0.01,CHFRMRNA表达水平降低和启动子区甲基化负相关R0.269,PO.015。BNHL患者中IIIIV期CHFRMRNA相对表达量为0.170。09,III期患者的相对表达量为0.230.13,前者明显低于后者,差异有统计学意义PO.024;BNHL按IPI评分分0~1分组和25分组,高评分组CHFRMRNA相对表达量为0.170.09,低评分组相对表达量为0.230.13,前者明显低于后者,差异具有统计学意义PO.042。CHFRMRNA相对表达量与患者发病时年龄、有无全身症状、LDH水平、EC06评分及性别无差异性P均0.05。发生甲基化的2L例BNHL患者中IIIIV期甲基化率为41.7%,III期患者甲基化率为13.3%,前者明显高于后者,二者差异具有统计学意义X28.36,PO.004;发生甲基化的21例患者中IPI评分01分组8例20%,25分组13例65%,二者CHFR甲基化表达存在差异X25.26,PO.022。CHFR甲基化在患者发病时年龄、有无全身症状、LDH水平、ECOG评分及性别方面的差异无统计学意义尸均0.05。结论①非霍奇金淋巴瘤组织中CHFR基因MRNA表达水平降低或缺失,CHFR基因启动子区异常甲基化在非霍奇金淋巴瘤中是频发事件,提示CHFRMRNA异常表达及启动子区甲基化参与了淋巴瘤的发生;②CHFR基因MRNA表达水平降低与其启动子区发生甲基化负相关,提示在非霍奇金淋巴瘤的发生过程中,CHFR启动子区甲基化可能导致了该基因MRNA表达下调或缺失,使CHFR基因对细胞有丝分裂的调控功能失活,从而导致淋巴瘤的发生;③CHAR基因表达下调及启动子区甲基化在BNHL患者的临床分期及IPI评分方面具有差异,提示CHFR基因可能与肿瘤的发生及进展相关,MRNA表达下调及启动子去甲基化是预后不良的因素。硕士研究生高艳华儿科学指导老师宋爱琴副教授关键词B细胞型非霍奇金淋巴瘤;CHFR基因;甲基化;实时荧光定量PCR;MSPSTUDYOFMRNAEXPRESSIONLEVELANDHYPERMETHYLAIONOFCHFRPROMOTERBCELLNONHODGKIN’SLYMPHOMAABSTRACTOBJECTIVETOINVESTIGATETHERELATIONSHIPBETWEENTHECHFREXPRESSIONLEVELANDABERRANTMETHYLATIONINNONHODGLDNLYMPHOMANHL,ANDANALYZEDTHECORRELATIONBETWEENCHFRABERRANTEXPRESSIONANDCLINICPATHOLOGICALCHARACTERISTICS.METHODSTHEEXPRESSIONOFCHFRMRNAWEREDETECTEDBYREALTIMEFLUORESCENCEQUANTITATIVEPCRASWELLAS38REACTIVEHYPERPLASIAOFLYMPHNODERHSAMPLES.THEMETHYLATIONSPECIFICPOLYMERASECHAINREACTIONMSPWASUSEDTOEXAMINETHEMETHYLATIONSTATUSOFCHFRGENEPROMOTERIN81NHLPATIENTSAND38RHTISSUES.RESULTSQCHFRMRNAWASSHOWNINTHERHGROUP,BUTTHELEVELOFMRNAEXPRESSIONWASSIGNIFICANTLYLOWERIN81BNHLEXAMPLES,ANDTHEMRNAWASLOSSEXPRESSIONIN2PATIENTS.THERELATIVEEXPRESSIONLEVELOFCHFRMRNAWAS0.21士0.12INBNHL,WHICHWASLOWERTHANCHFRMRNAINRHGROUP0.2740.13.ABERRANTPROMOTERMETHYLATIONOFTHECHFRGENEWASDETECTEDIN21OF81BNHLSAMPLES25.9%,WHICHNOMETHYLATIONWASDETECTEDINRHTISSUES,THEDISCREPANCYHADSTATISTICALSIGNIFICANCEP0.001.THECHFRMRNAEXPRESSIONLEVELWAS0.1340.05INTHEABERRANTMETHYLATIONPATIENTS,WHICHWASSIGNIFICANTLYLOWERTHANTHATINUNMETHYLATIONPATIENTS0.2340.12.THEEXPRESSIONOFMRNAWASASSOCIATEDWITHTHEMETHYLATION,THECORRELATIONCOEFFICIENTWAS舻0.296,P0.015.③THECHFRMRNAEXPRESSIONLEVELWAS0.1740.09ATIIIIVSTAGE,WHICHWAS0.2340.13ATIIISTAGEOFBNHL,THEDISCREPANCYHADSTATISTICALSIGNIFICANCE尸0.024,BNHLDIVIDEDINTO01GROUPAND25GROUPACCORDINGTOIPISCORE,THEHI曲SCOREGROUPEXPRESSIONLEVELBELOWTHELOWSCOREGROUPP0.042.HOWEVER,THEEXPRESSIONLEVELOFCHFRMRNAWASNOCORRELATED谢TLLCLINICALCHARACTER,SUCHASAGE,GENDELBSYMPTOMS,SERUMLDHANDECOG.THEABERRANTMETHYLATIONOFCHFRWASOBSERVEDIN613.3%OFTHEPATIENTSATTHESTAGEIIIOFNHL,IN1541。7%OFTHEPATIENTSATTHESTAGEIIIIV.THEREWASSIGNIFICANTDIFFERENCEBETWEENTHESTAGEOFLYMPHOMAANDTHEABERRANTMETHYLATIONOFCHFR∥8.36,P0.004.ANOTHERDIFFERENCEWASOBSERVEDINIPISCORE,HIGHIPISCORENHLISMORE丘EQUENTLYMETHYLATEDTHANLOWIPISCORE贮5.26,P0.022.THEABERRANTMETHYLATIONOFCHFRGENEINBNHLHADNOCORRELATIONWITHOTHERCLINICPATHOLOGICALCHARACTERISTICS,SUCHASAGE,GENDER,BSYMPTOMS,SERUMLDHANDECOG.CONCLUSIONOTHECHFRMRNAEXPRESSIONWASDOWNREGULATIONOR10SSINB二NHL,ANDBERRANTMETHYLATIONOFCHFRWASA丘EQUENTEVENTINBJNHL,WHICHMAYCONTRIBUTETOTHEOCCURRENCEOFBNHL.②THECHFRMETHYLATIONWASASSOCIATEDWITHTHEEXPRESSIONOFMRNA,INDICATEDTHATTHEDOWNREGULATIONANDLOSSOFMRNACAUSEDBYMETHYLATION.TLLISMADECHFRLOSSOFFUNCTIONTOMITOSISANDLEADTOTHEOCCURRENCEOFLYMPHOMA.③ASCHFRMRNAEXPRESSIONTEVELANDPROMOTERABERRANTMETHYLATIONWASASSOCIATEDWITHTUMORSTAGEANDIPISCORE,ITMAYINDICATETHEMALIGNANCYANDPROGRESSOFB_NHLANDCHFRMAYBECOMEADIAGNOSTICANDTHERAPEUTICMARKERGENEINTHEFUTUREPOSTGRADUATESTUDENTGAOYANHUAPEDIATRICSDIRECTEDBYPROF.SONGAIQINKEYWORDBCELLNONHODGKIN’SLYMPHOMA;CHFRGENE;METHYLATION;REALTIMEFLUORESCENCEQUANTITATIVEPCR;MSP目录引言1第1章材料..21.1研究对象.21.2主要仪器.21.3主要试剂.3第2章方法..42.1BNHL组织CHFR基因MRNA表达水平的检测..42.1L引物的设计与合成42.1.2BNHL及RH石蜡标本组织RNA提取.42.1.3逆转录反应.52.1。4实时荧光定量PCR。62.2MSP检测BNHL中CHFR基因甲基化状态..62.2.1BNHL及RH石蜡标本组织DNA的提取..62.2.2亚硫酸氢钠修饰基因组DNA..72.2.3DNA纯化过柱回收.72.2.4甲基化特异性PCR阳性对照..82.2.5甲基化特异性PCR扩增MSP.82.2.6DHPLC检测MSP扩增产物.92.3统计学处理..10第3章结果....1L3.1BNHL组织中CHFR基因表达情况...1L3.1.1BNHL组织中CHFR基因MRNA表达情况113.1.2BNHL组织中CHFR基因甲基化情况..123.2BNHL组织中CHFR基因甲基化与MRNA表达水平相关性.123.3BNHL组织中CHFR基因与临床病理特征的关系..133.3.1BNHL中CHFR基因MRNA表达与临床病理特征的关系..133.3.2BNHL中CHFR基因甲基化与临床病理特征的关系..15第4章讨论.174.1.BNHL患者中CHFR基因的表达水平及启动子区甲基化174.2CHFR表达及启动子区甲基化与BNHL临床病理特征..184.3展望.19结论..21参考文献.22综述..27参考文献.34攻读学位期间研究成果.40附录..41致谢..43学位论文独创性声明学位论文知识产权权属声明..44青岛大学硕士学位论文引言非霍奇金淋巴瘤NONHODGKINLYMPHOMA,NHL是~组起源于淋巴结和或结外器官的恶性肿瘤,易发生骨髓浸润,是最常见的恶性肿瘤之一N1。NHL可分为T细胞及B细胞两种细胞来源,其中BNHL占90%∞1。BNHL可发生于各个年龄组,发病率与年龄成正相关。随着放化疗以及免疫治疗的综合开展,患者的预后有很大改善,但因淋巴瘤病理类型及临床特征各有特点,造成患者对治疗反应的极大不同,从而呈现出高度的肿瘤异质性,导致个体预后的极大差异。随着对肿瘤发病机制研究的逐渐深入,肿瘤的研究热点逐渐从癌基因转移到抑癌基因,并发现后者在肿瘤发生发展中起着更重要的作用。大量研究证实,抑癌基因启动子区的异常高甲基化对肿瘤的发生及发展有着重要作用,多种肿瘤组织中的多种基因可检测到异常高甲基化口4儿5|。DNA甲基化是一种共价化学修饰,属于表观遗传学研究的主要内容之一。DNA甲基化可调控基因的表达,其可通过抑制RNA聚合酶活性、与特异性结合蛋白结合、改变染色质结构及阻碍转录因子与DNA结合等方式抑制基因的表达,引起转录后基因沉默。CHFRCHECKPOINTWITHFHAANDRINGFINGER是SCOLNICK哺’等于2000年发现的抑癌基因,定位于12Q24.33,是一个新的有丝分裂前期检查点基因,其编码产物为664个氨基酸的蛋白质,是一种能够控制细胞有丝分裂及检测正常细胞有丝分裂周期的功能蛋白。当细胞遭遇有丝分裂应激时,CHFR通过抑制染色体的聚集及中心体的分离阻滞细胞于有丝分裂G2/M期∞1。研究发现CHFR泛素化表达于人体正常组织,但在食管癌、肺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中该基因低表达甚至缺失口吲,提示该基因的变异可能与肿瘤的发生有着密切的关系。随着表观遗传学研究的发展,抑癌基因启动子区CPG岛的高甲基化已被当作引起转录沉默的普遍机制N0I。启动子区CPG岛甲基化导致CHFR表达下调或缺失在人类肿瘤细胞中被证实,包括食管癌、结肠癌、胆囊癌、口腔鳞状细胞癌、肺癌、头颈部鳞状细胞癌及皮肤T细胞淋巴瘤UH73等。但有关CHFR基因甲基化在淋巴瘤发病中所起的作用却少见报道。本研究通过检测BNHL患者组织标本中CHFR基因MRAN的表达及甲基化水平,分析其与BNHL临床特征之间的关系,以期为阐明BNHL的发病机制及基因靶向治疗提供新的线索。材料第1章材料1.1研究对象收集2009年1月至2012年3月在青岛大学医学院附属医院确诊的B细胞非霍奇金淋巴瘤BNHL石蜡标本81例,男52例,女29例;年龄386岁,平均年龄48.6919.89岁;淋巴结反应性增生RH组织石蜡标本38例作为对照组。所有病例均由2位病理医生按照WH02008年淋巴造血组织分类新标准重新阅片分类,弥漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL34例,介于弥漫大B细胞性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤之间不能分类的B细胞淋巴瘤DLBCL/BL6例,滤泡性淋巴瘤FL7例,结外粘膜相关淋巴组织边缘带淋巴瘤MALT淋巴瘤12例,伯基特淋巴瘤BL8例,套细胞性淋巴瘤MCL6例,淋巴浆细胞性淋巴瘤LPL3例,小淋巴细胞性淋巴瘤SLL3例,B细胞淋巴母细胞性淋巴瘤LBL2例。同时整理患者的临床病理资料如B症状盗汗、发热及体重减轻、LDH≤245U/L为正常、ECOG评分及IPI评分包括年龄、一般状况、血LDH、结外受累部位及临床分期,所有患者均按照ANN/ARBOR分期系统标准进行分期,其中早期工期II期45例,晚期III期IV期36例。所有患者术前均未接受糖皮质激素及其它免疫抑制剂、化疗以及放疗等治疗。1.2主要仪器超净工作台型号SWCJ一1FD购自苏州安泰空气技术有限公司制冰机型号SIMF140购自日本SANYO公司紫外分光光度计型号22331购自德国EPPENDORF公司普通PCR扩增仪型号GENEAMP2400购自PE公司荧光定量PCR扩增仪型号ABL7500购自美国APPLIEDBIOSYSTEMS公司DHPLC仪器型号HSX一3500购自美国TRANSGENOMIC公司高速离心机型号5415D购自德国EPPENDORF公司超纯水仪型号PLSL21购自PALL公司超低温冰箱型号DW一86L388购自青岛海尔公司低温冰箱型号BCD一196T购自青岛海尔公司电热恒温水浴锅购自龙口市先科仪器公司青岛大学硕士学位论文干式恒温器购白杭州奥盛仪器公司电子天平购白美国SARRORIUS公司震荡仪型号HEIDOLPHMR300Z型购白SCIENTIFICINDUSTRIES公司移液器购白德国EPPENDORF公司1.3主要试剂石蜡包埋组织RNA抽提试剂盒货号W7071购自上海华舜生物工程有限公司逆转录试剂盒TAKARA货号DRR014A购自宝生物工程大连有限公司荧光定量PCR试剂盒TAKARA货号DRR820A购自宝生物工程大连有限公司石蜡包埋组织DNA抽提试剂盒货号D3399一01购自PROMEGA公司PROMEGAWIZARDCLEANUPDNA纯化回收试剂盒货号A7280购自PROMEGA公司脱蜡液购自南京化学试剂有限公司无水乙醇购自南京化学试剂有限公司亚硫酸氢钠购自美国SIGMA公司对苯二酚购自美国SIGMA公司M.SSSI甲基转移酶购自NEWENGLANDBIOLABS,INC.公司乙腈购白美国FISHER公司TEAA购购自美国TRANSGENOMIC公司异丙醇购自南京化学试剂有限公司

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