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CD40siRNA慢病毒载体的构建及其对EAM大鼠Treg细胞的影响

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CD40siRNA慢病毒载体的构建及其对EAM大鼠Treg细胞的影响

分类号R725.4密级单位代码10422学号201013252⑧∥菇办孚硕士学位论文论文题目CD40siRNA慢病毒载体的构建及其对EAM大鼠Treg细胞的影响ConstructionofCD40siRNAlentiviralvectorandeffectofCD40siRNAonTregcellsinratswithEAM作者姓名学院名称专业名称指导教师合作导师王介忠医学院儿科学韩波教授2013年4月20日原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名互葺L日期矽l罗.f∈/关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定论文作者签名秀牡导师签名目录中文摘要1英文摘要3符号说明6前言7日U舌7第一部分大鼠CD40基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定材料与方法8结果18口7K16讨论19小结21参考文献22第二部分CD40siRNA对自身免疫性心肌炎大鼠Treg细胞的影响材料与方法23结果26讨论28参考文献31附图32综述39致谢45CONTENTSAbstractinChinese1AbstractinEnglish...........................................................................3Symboldescription........................................................................6Intl70duction7PartOneConstructionandIdentificationofRNAInterferenceLentiviralVectorTargetingCD40GeneinRatsMaterialsandmethods..........................................................................8Results......18Discussion...........。。...........。..。....................19Conclusion............21References.。......。。.....。.........。.....................。...22PartTwoEffectofCD40siRNAonregulatoryTcellsinratswithexperimentalautoimmunemyocarditisMaterialsandmethods.23Results..................26Discussion...............18Conclusion30References......31Figures32Reviews............39Acknowledgment45山东大学硕士学位论文CD40siRNA慢病毒载体的构建及其对EAM大鼠Treg细胞的影响专业硕士研究生导师儿科学王介忠韩波教授中文摘要研究背景、目的病毒性心肌炎VMC是儿科心血管系统常见疾病,严重危害儿童身体健康,其发病机制尚未完全阐明,亦无特效治疗。目前研究认为,主要是病毒感染及其诱导的免疫应答导致的心肌损伤,其中T淋巴细胞介导的细胞免疫起主导作用,研究病毒性心肌炎的免疫机制己成为当前国内外热点内容。实验性自身免疫性心肌炎EAM大鼠模型因其病情进展与人心肌炎极为相似,为研究心肌炎的免疫机制提供了最佳的动物模型。T淋巴细胞介导的细胞免疫需双信号的活化,其中CD40与CD40配体CD40L是重要的共刺激信号通路之一。研究表明应用CD40.Ig阻断CD40/CD40L通路,能显著减轻病毒性心肌炎小鼠心肌炎症。能否应用RNA干扰技术从免疫反应的源头即通过沉默CD40的表达来减轻心肌炎症反应,国内外尚未见文献报道。本实验首先针对大鼠CD40基因构建了CD40siRNA慢病毒载体,然后应用于EAM大鼠,探讨CD40siRNA对心肌免疫损伤的治疗作用及对CD4CD25调节性T细胞Tregs的影响。研究方法1.针对大鼠CD40基因RNAi设计有效靶序列,合成靶序列的寡核苷酸序列。退火形成双链DNA,与经HpaI和XhoI双酶切后的GVl18载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。随后进行Western.blot外源筛选最佳干扰靶点、慢病毒包装及病毒滴度测定。1山东大学硕士学位论文2.40只雄性Lewis大鼠随机分成4组,即正常对照组、EAM模型组、CD40siRNA治疗组及siRNA对照组,每组10只大鼠。于实验第1天、第8天,正常对照组大鼠双后肢足垫区皮下注射PBS缓冲液0.2ml/只另外三组大鼠双后足足垫区皮下注射充分混合的猪心肌球蛋白0.2ml/只。并且于实验第8天,CD40siRNA治疗组尾静脉注射25p,1CD40siRNA慢病毒表达载体siRNA对照组尾静脉注射25I.tlsiRNA慢病毒表达载体。于实验第21天处死所有大鼠,光镜下观察心肌病理变化并计算病理积分流式细胞仪检测大鼠脾脏中CD4CD25Treg的表达。研究结果1.CD40siRNA成功插入慢病毒载体。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为2.0109TU/mL。2.各组大鼠均无死亡,正常对照组大鼠饮食、精神状态良好,其他3组于实验第4天渐出现精神不振、耸毛、进食少、懒动,部分大鼠双足垫出现溃疡、踝关节肿胀,以EAM模型组明显。3.EAM模型组心肌病理组织可见炎症细胞浸润,伴有心肌细胞肥大变性,相邻细胞间隙增大,核大深染CD40siRNA治疗组心肌组织病理积分明显低于EAM模型组2.34士0.60vs3.40士0.35,p0.05。4.CD40siRNA治疗组大鼠脾脏CD4CD25Treg的表达较EAM模型组明显上调40.7014.00W12.20士1.10,p0.05。研究结论1.成功构建大鼠CD40基因的RNAi慢病毒载体,为后期进一步研究病毒性心肌炎发病机制及新的治疗方法提供工作基础。2.CD40siRNA可减轻EAM大鼠的心肌炎症,其机制可能与上调CD4CD25Treg的表达有关。关键词CD40siRNA自身免疫性心肌炎大鼠调节性T细胞山东大学硕士学位论文ConstructionofCD40siRNAlentiviralvectorandeffectofCD40siRNAonTregcellsinratswithEAMSpecialtyPostGraduateSupervisorBackgroundandObjectivePediatricsWangJiezhongProf.HanBoEnglishAbstractViralmyocarditisisacommondiseaseofthepediatriccardiovascularsystem,whichseriouslyinfluencethechildrenShealth.Todate,thepathomechanismisnotyetfullyelucidatedandthereisnospecificoreffectivetreatementforthedisease.Itisreportedthatvirusesinfectioninducedimmuneresponsescausemyocardialinjury.Inthisprocess,Tlymphocytemediatedcellularimmunityplaysadominantrole.Therefore,studyonthemechanismofviralmyocarditishasbecomeahotpointintheworldScurrentresearch.Experimentalautoimmunemyocarditisratmodelwassupportedasthebestmodelforthestudyofmyocarditis.Tlymphocytemediatedcellularimmunityneedsactivationofdualsignal.CD40andCD40ligandCD40Lisoneoftheimportantcostimulatorysignalpathways.StudiesrevealedthatblocktheCD40/CD40LsignalbyCD40一Igcouldalleviateviralmyocarditis.ItwasunknownwhetherRNAinterferencecouldreducetheexpressionofCD40silencefromthesourceoftheimmuneresponseinflammatoryreaction.InthisstudNwefirstconstructtheCD40siRNAlentiviralvectoranddeterminedthetherapeuticeffectofCD40siRNAinviralmyocarditisandtheeffectofCD4CD25regulatoryTcells.Methods1.EffectivetargetsequencesthattargetatCD40geneweredesigned,thensynthetizedtheoligonucleotidesequencesAfterannealingofthecomplementarystrands,theDNAfragmentswereconnectedtotheGVll8vectorsbydoubledigestionwithHpaIandXhoI,toconstructthelentiviralvectorswhichexpressedshorthairpin3山东大学硕士学位论文RNA.ThelentiviralvectorswereidentifiedbyPCRandDNAsequencing.Westernblotwasemployedtosortthebestinterferingtargetsexogenously,andlentiviralpackagingandassayingviraltiterwerealsoaccomplished.2.40maleLewisratswererandomlydividedintofourgroups,Thenormalcontrolgroup,theEAMmodelgroup,CD40siRNAtreatmentgroupandsiRNAtreatmentgroup,thereare10ratsineachgroup.At1stday,8thday,subcutaneousinjectionPBSbuffer0.2mlinthetwohindfootpadoftheratsofthecontrolgroupwhiletheotherthreegroupsofratssubcutaneousinjectionofmixedsufficientlyporcinecardiacmyosin0.2mlinthetwo11indfootpad.Andatthe8thday,251ACD40siRNAlentiviralexpressionvectorwasinjectedthroughtailveinintheCD40siRNAtreatmentgroupLentiviralsiRNAgroupWasinjectedwith259lsiRNAexpressionvector.Allratsweresacrificedin21thday,myocardialpathologicalchangesandcalculatethepathologicalintegralunderlightmicroscopeCD4CD25TregexpressioninratspleenwasdeterminedbyflowcytometerResults1.CD40siRNAsuccessfully1nsertedIntothe1entiviralvectorsandtheIentiviralvectorwaspackagedin293Tcells.Thedeterminationofvirustiterwas2.0109TU/ML.2.Therewasnodeathineachgroup.Thenormalcontrolratseatwellandwereingoodspirits.Inthe4mdaytheotherthreegroupsgraduallyappearslackofenergy.toweringhair,eatingless,lazymoving.Partoftheratsulcerinfeetpad,ankleswelling,whichwasobviousinEAMmodelgroup.3.InflammatorycellinfiltrationwasobservedinpathologictissueofEAMmodel,accompaniedwithmyocardialthecellhypertrophydegeneration,theadjacentcellgapincreases,andalargedeeplystainedinnucleusCD40siRNAgroupmyocardialhistopathologyintegralWassignificantlylowerthanthetheEAMmodelgroup2.3440.60VS3.4040.35,P0.05.4.CD4CD25TregexpressioninCD40siRNAratspleenofEAMmodelgroupweresignificantlyincreased40.7044.00VS12.2041.10,PO.05.Conelusions4山东大学硕士学位论文1.TheRNAinterferencelentiviralvectortargetingtheCD40geneinratswasconstructedsuccessfully,whichwillprovidethefoundationforfurtherexploringthepathogenesisofviralmyocarditisandnewtreatmentsinfuture.2.CD40siRNACanreducemyocarditisofEAMrats,Thethemechanismmayberelaedtoup.regulationofCD4CD25TregSexpression.KeywordsCD40siRNAEAMratTreg

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