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EV71脑炎血脑屏障损伤的相关性研究

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EV71脑炎血脑屏障损伤的相关性研究

课题题目肠道病毒71EV71脑炎血脑屏障损伤的相关性研究实验包括实验一、动物实验部分题目EV71感染小鼠脑组织埘P一9、MMP一2的表达与血脑屏障损伤的相关研究’关键词肠道病毒71型;基质金属蛋白酶一9;基质金属蛋白酶2;血脑屏障;实验二、临床实验部分题目MMP一91562、TNFQ308基因多态性与EV71重症脑炎易感性研究关键词肠道病毒71型;金属蛋白酶MMPS,金属蛋白酶9MMP一9;肿瘤坏死因子QTNFQ;多态性;综述题目MMP一2、删P一9与中枢神经系统疾病的相关研究进展硕士研究生辛丹丹指导教师陈宗波教授实验一、EV71感染小鼠脑组织MMP一9、MMP一2的表达与血脑屏障损伤的相关研究,.中文摘要/铿燃必目的通过制作EV71感染ICRD、鼠模型,观察EV71感染后小鼠的生存情况,检测不同时间点脑干及大脑组织MMP一9和删P一2的表达水平、脑组织含水量、脑组织毛细血管形态和结构变化情况,探讨EV71感染小鼠脑组织贼P一9、麟P一2的表达与血脑屏障损伤的相关性。方法SPF级ICR小鼠腹腔注射肠道病毒7L型EV71制造EV71病毒性脑炎模型,于感染后L、3、5、7、LO、14天,分别取小鼠大脑及脑干组织,应用QRTPCR检测MMP.9RNRNA和MMP.2MRNA的表达情况,ELISA方法检测MMP.9和MMP2蛋白表达情况,应用透射显微镜检测大脑及脑干脑毛细血管结构变化以及脑组织含水量了解血脑屏障损伤情况。结果1.EV71感染第1、3天脑干组与同时间点EV71感染大脑组比较,MMP.9MRNA表达量及其蛋白浓度显著增加P0.01。2.EV71感染后第L、3天,EV71脑干组MMP.2MRNA表达量及其蛋白浓度显著高于EV71大脑组PO.05。3.EV71感染后第L、3天脑干含水量较大脑含水量显著增加P0.001。4.EV71感染后第1天电镜下观察脑干毛细血管结构损害较EV71感染大脑组明显;感染后第3、5天脑干及大脑毛细血管结构均显著破坏;EV71感染后第7天大脑及第10天脑干血脑屏障结构渐恢复。结论1.EV71病毒性脑炎呈急性经过,感染极早期脑于血脑屏障较大脑的血脑屏障更易受损,且恢复较大脑组织缓慢。2.EV71感染后,MMP.9、MMP.2的表达量增高与血脑屏障损害及脑水肿程度呈正相关,推测MMP.9、MMP.2参与了EV71病毒性脑炎血脑屏障损伤的病理生理过程,且MMP.2可能在EV71病毒性脑炎早期的血脑屏障损害中起到更重要作用。关键词肠道病毒71型;基质金属蛋白酶_9;基质金属蛋白酶2;血脑屏障;ABSTRACTPARTICORRELATIONRESEARCHONMMP一9AND2EXPRESSIONOFEV71INFECTEDMICEBRAINTISSUEANDDAMAGESTOBLOODBRAINBARRIEROBJECTIVETOOBSERVETHESURVIVALOFEV71INFECTEDMICE,DETECTTHEMMP一9AND2EXPRESSIONLEVELOFBRAINSTEMANDBRAINTISSUE,WATERCONTENTINBRAINTISSUEASWELLASBLOODCAPILLARYSHAPEANDSTRUCTURALCHANGEOFBRAINTISSUEANDFINALLYDISCUSSTHECORRELATIONBETWEENMMP9AND2EXPRESSIONOFEV7LINFECTEDMICEBRAINTISSUEANDDAMAGESTOBLOODBRAINBARRIERTHROUGHFABRICATINGEV71INFECTIONMODEL.METHODFABRICATEEV71VIRALENCEPHALITISWITHSPFLEVELICRMICEABDOMINALINJECTIONOFINTESTINALTRACTVIRUS71TYPEEV71,TAKEOUTMICEBRAINANDITSBRAINSTEMTISSUEAFTERTHEMICEISINFECTEDFOR1,3,5,7,10,AND14DAYSRESPECTIVELY;DETECTTHEEXPRESSIONOFMMP一9MRNAANDMMP2MRNATHROUGHQRTPCR,MM9AND2PROTEINEXPRESSIONTHROUGHELISAANDSTRUCTURALCHANGEINBRAINANDBRAINSTEMBLOODCAPILLARYANDWATERCONTENTINBRAINTISSUEWIMTRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPETOKNOWABOUTTHEDAMAGESTOBLOODBRAINBARRIENRESULT1.THROUGHCOMPARISONOFBRAINSTEMTISSUEGROUPAFTERINFECTEDWITLLEV71FOR1AND3DAYSINTOEV71INFECTEDBRAINGROUPINTHESAMETIMEANDATSAMEPLACE,THEMMP9MRNAEXPRESSIONANDITSPROTEINCONCENTRATIONISREMARKABLYINCREASEDPO.01.2.AFTERINFECTEDWITHEV71FORLAND3DAYS,MMP2MRNAEXPRESSIONANDPROTEINCONCENTRATIONOFEV71BRAINSTEMGROUPISREMARKABLYHIGHERTHANTHATOFEV71BRAINGROUPPO.05.3.AFTERINFECTED谢MEV71FOR1AND3DAYS,THEWATERCONTENTINBRAINSTEMISREMARKABLYINCREASEDTHANTHATINBRAIN.4.AFTERLNDAY’SEV71INFECTION,THEDAMAGESTOTHEBRAINSTEMBLOODCAPILLARYSTRUCTUREISMOREOBVIOUSTHANTHATOFTHEBRAINGROUPINFECTEDWITLLEV71WHENOBSERVEDUNDERTHEELECTRONMICROSCOPE;AFTER3RDAND5TIIDAY’SINFECTION,THEBRAINSTEMANDBRAINBLOODCAPILLARYSTRUCTUREAREREMARKABLYDAMAGED;THEBRAINAFTERINFECTEDWITHEV71FOR舭7曲DAYANDTHEBRAINSTEMBLOODBRAINBARRIERSTRUCTUREAFTERINFECTEDWITHEV71FORME10TILDAYAREGRADUALLYRECOVERED.CONELUSION1.EV71VIRALBRAINENCEPHALITISISACUTE,THEBLOODBRAINBARRIEROFTHEBRAINWITHLARGERBRAINSTEMBLOODBRAINBARRIERISEASIERTOBEDAMAGEDATTHEEARLYSTAGEOFINFECTION,ANDITISRECOVEREDMORESLOWLYTHANTHEBRAINTISSUE.2.AFTEREV71INFECTION,THEINCREASEINMMP9AND2EXPRESSIONQUANTITYISPOSITIVELYCORRELATEDTOBLOODBRAINBARRIERANDENCEPHALEDEMADEGREE.ITISRECKONEDTHATMMP一9AND2PARTICIPATESINPATHOLOGICALANDPHYSIOLOGICALPROCESSOFEV71VIRALENCEPHALITISBLOODBRAINBARRIERANDLVLLVLP一2MIGHTPLAYANIMPORTANTROLEINPATHOLOGICALANDPHYSIOLOGICALPROCESSOFBLOODBRAINBARRIERATTHEEARLYSTAGEOFEV71VIRALENCEPHALITIS.POSTGRADUATESTUDENTXINDANDANPEADIATDCSDIRECTEDBYPROLCHENZONGBOKEYWORDSENTEROVIRUS71;MATRIXMETAILOPROTEINASE9MMP9;MATRIXMETALIOPROTEINASE2BLOODBRAINBARRIERBBB实验二}MVIP91562、TNFQ308基因多态性与EV71重症脑炎易感性研究中文摘要目的研究MMP一91562、TNFA308位点基因多态性与EV71脑炎病情严重程度的关系,探讨EV71重症脑炎的遗传易感因素。方法收集2010年10月至2011年10月EV71检测阳性的中枢神经系统感染患儿184例,收集同时期同地区的健康查体儿童共237例,分别提取患儿及健康儿童外周血白细胞的基因组DNA,通过序列特异性引物一聚合酶链反应PCRRFLP技术检测EV71病毒性脑炎患儿及正常对照组儿童基因组TNFA308、MMP91562位点单核苷酸多态性。结果EV71重症脑炎组TNFCL308位点A等位基因频率分布明显高于轻症组16%VS6.4%,OR2.646,95%CI1.291~5.421,P0.05,EV71脑炎组与正常对照组该位点A等位基因频率分布具有统计学意义9.2%VS5.5%,OR.1.754,95%CI1.033.2.980,P0.05;EV71重症脑炎组与轻症组MMP91562位点T等位基因频率分布存在明显差异16%VS7.5%,OR2.362,95%CI1.17叫.768,P0.05;EV71重症脑炎组与轻症组,MMP91562位点CT、TT/TNF.A一308位点GA、从组合基因型与MMP一91562位点CT、TT/TNFA308位点GG组合基因型分布差异有统计学意义46.7%VS15%,矛4.212,P0.05。结论TNFA一308位点A等位基因及MMP91562位点T等位基因可增加EV71重症脑炎的患病风险,可能是EV71重症脑炎的遗传易感基因;TNFQ一308位点基因型GG可能为避免感染EV71后发展为重症脑炎的保护基因型。硕士研究生辛丹丹研究生指导教师陈宗波教授关键词肠道病毒71型;金属蛋白酶埘PS,金属蛋白酶9MMP一9;肿瘤坏死因子QTNFA;多态性;PART2ABSTRACTASSOCIATIONOFMATRIXMETALIOPROTEINASE一9ANDTUMORNECROSISFACTORALPHAGENEPOLYMORPHISMSWITHRISKOFSEVEREENCEPHALITISINENTEROVIRUS71INFECTEDCHILDRENOBJECTIVETOINVESTIGATETHERELATIONSHIPBETWEENTHEPOLYMORPHISMSOFTNFA308ANDMATRIXMETALLOPROTEINASE.9MMP.9、.1562WITHTHESUSCEPTIBILITYOFENTEROVIRUS71ENCEPHALITIS,ANDEXPLORETHERISKFACTORSOFEV71ENCEPHALITIS.METHODREVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERSECHAINREACTIONRTPCRWASUSEDTODETECTTHESPECIFICPRIMERSOFEV71INTHEFAECESOFPATIENTSWITHEV71INFECTION.GENOMICDNAOFWHITEBLOODEELLWEREEXTRACTEDJHENPOLYMERASECHAINREACTIONRESTRICTIONFRAGMEMLENGTHPOLYMORPHISMPCRRFLPTECHNIQUESWEREPERFORMEDTODETERMINETHEGENOTYPESOFN佃。.9GENEANDAPOLYMERASECHAINREACTIONWITHSEQUENCESPECIFICPRIMERSPCR.SSPSYSTEMWEREUSEDTODETERMINEGENOTYPEFORTHEA/GPOLYMORPHISMAT.308POSITIONOF1冬Ⅲ一A308GENEINENCEPHALITISGROUPANDINCONTROLGROUP.RESULTSTHETNF.A.308AALLELEWASOBSERVEDWITHSIGIFICANTLYGREATERFREQUENCYINPATIENTSWITHSERIOUSEV71ENCEPHALITISCOMPAREDWITHSLIGHTEV71ENCEPHALITISPATIENTS16%VS6.4%,OR2.646,95%CI1.2915.421,P0.05;INEV7LENCEPHALITISGROUP,AALLELEOFN虾‘.仅.308WEREMORECOMMONTHANTHATINCONTROLGROUP9.2%VS5.5%.OR1.754.95%CI1.033.2.980,P0.05.SIMILARLY,THEMMP一9一1562TALLELEWASOBSERVEDWITHSIGNIFICANTLYGREATERFREQUENCYINPATIENTSWITHSERIOUSEV71ENCEPHALITIS16%COMPAREDWITHSLIGHTEV71ENCEPHALITISPATIENTS7.5%OR2.362,95%C11.1704.768,P0.05;PEOPLEWHOSEGENOTYPESCORNBINATIONWASMMP.9.1562C1R,1M/M.GT.308GA/AAWEREMOREEASILYTOSUFFERWITHSERIOUSEV71ENCEPHALITISTHANTHOSEWHOSEENOTYPESCOMBINATIONWASMMP.9.1562CT/TT/TNF.IX.308GG.46.7%VS15%,CZ4.212,P0.05.CONCLUSIONTHEPOLYMORPHISMOF1小限一A308ANDMN皿91562SINGLENUCLEOTIDEMAYCORRELATEWIMEV71SERIOUSENCEPHALITIS.MAYBE11、IFA一308GGISTHEPROTECTIVEGENOTYPEWHICHPROTECTCHILDRENKEEPAWAYFROMEV71SERIOUSENCEPHALITIS.THATTHEREISACLOSERELATIONSHIPBETWEENGENETICPOLYMORPHISM308A/GONTNFAGENEANDGENETICPOLYMORPHISM1562C厂RONM卟僵P9GENEWITHTHESEVERITYOFEV71INFECTEDCHILDREN.POSTGRADUATESTUDENTXINDANDAⅡPEADIATRICSDIRECTEDBYPROF.CHENZONGBOKEYWORDSENTEROVIRUS71;MATRIXMETALLOPROTEINASE;MATRIXMETALLOPROTEINASE9MMP9;TUMORNECROSISFACTORGTNF帕O;POLYMORPHISMS,SINGLENUEIEOFID目录一、EV71感染小鼠脑组织MMP.9、MMP2的表达与血脑屏障损伤的相关研究引言1第一章材料与方法21.1材料。21.2方法。3第二章结果62.1小鼠生存情况.62.2小鼠脑组织EV71表达情况。62.3QRTPCR检测脑组织MMP9、MMP2MRNA表达情况62.4ELISA检测脑组织MMP一9、MMP2表达水平82.5小鼠脑组织血脑屏障结构改变情况。..1L2.6脑组织含水量变化情况.J13第三章讨论14第四章结论16参考文献17二、MMP.9.1562、TNF.仅.308基因多态性与EV71重症脑炎易感性研究引言...18第一章材料与方法.191.1材料.....191.2方法。20第二章结果232.1一般情况.232.2TNF.A一308及MMP一91562位点基因多态性分析23第三章讨论27第四章结论29参考文献.30综述.32综述参考文献.36攻读学位期间的研究成果39致谢..40学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明41英文缩写EV71H心但NEMP.9N附.2ECMBBBTNFSNP几CNS缩略词索引表英文全称ENTEROVIRUS71MATRIXMETALLOPROTEINASEMATRIXMETALLOPROTEINASE9MATRIXMETALLOPROTEINASE2EXTRACELLULARMATRIXBLOODBRAINBARRIERTUMORNECROSISFACTORSINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISMINTERLEUKINCENTRALNERVOUSSYSTEM中文译名肠道病毒71型基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶.9基质金属蛋白酶.2细胞外基质血脑屏障肿瘤坏死因子单核苷酸多态性白介素中枢神经系统引言实验一、EV71感染小鼠脑组织MMP一9、MMP2的表达与血脑屏障损伤的相关研究引言肠道病毒71型ENTEROVIRUS71是单链小RNA病毒由7408个核苷酸组成,EV71感染在全球范围内已有多次爆发与流行,近年来EV71在我国的流行呈显著上升的趋势N喇。EV71感染通常主要累及5岁以下的儿童,重症致死者多见于3岁以下的D,JL,一般儿童感染EV71后临床表现主要以手足口疱疹为特征,但部分患儿可出现持续高热、频繁抽搐、意识障碍及延髓的广泛损害,并较易侵犯脑干神经核,引起神经源性肺水肿、心功能障碍和休克,导致患儿病死阳3。但现阶段国内外对EV71感染的发病机制尚未明确。血脑屏障BLOODBRAINBARRIER,BBB是中枢神经系统CEMRALNERVOUSSYSTEM,CNS抵御外界炎症反应,维持中枢内环境稳定的重要结构,由内皮细胞、内皮细胞间的紧密连接、毛细血管基底膜、星形胶质细胞及其终足、周皮细胞和小胶质细胞共同构成3。脑血管基底膜是一种特殊的细胞外基质EXTRACELLULARMATRIX,ECM,主要由IV型胶原蛋白、层粘连蛋白及其它糖蛋白构成,而国内外实验研究证实上述结构蛋白是基质金属蛋白酶家族MATRIXMETALLOPROTEINASE,MMPS的作用底物【8】,MMPS降解脑毛细血管基底膜可导致BBB开放或通透性增加,而致毛细血管内水分渗出导致血管源性脑水肿和继发性脑组织损伤的发生。ROSENBERG等研究发现,向小鼠脑组织中注入基质金属蛋白酶.9MATRIXMETALLOPROTEINASE.9,MMP.9和基质金属蛋白酶.2MATRIXMETALLOPROTEINASE.2,MMP.2或诱导其产生均可导致ECM降解和BBB的开放19,考虑MMP9和MMP2的异常表达可能与血脑屏障的损伤存在重要相关性。单纯疱疹病毒动物实验研究表明,单纯疱疹病毒性脑炎,MMP9表达增高可增力IBBB通透性,应用删P一9的抑制剂后,可降{K毛BBB的通透性,减轻脑水肿N训。EV71病毒与单纯疱疹病毒同属于嗜神经性病毒,由此我们推测,EV71感染后所引起的脑组织损伤可能与血脑屏障的损伤直接相关,但目前国内外尚未见相关实验研究。因此,我们通过制作EV71感染小鼠模型,观察EV71感染后小鼠的生存情况,检测不同时间点,脑干及大脑组织MMP9和MMP2的表达水平、脑组织含水量及脑毛细血管形态和结构变化情况,探讨EV71感染小鼠脑组织MMP9、MMP2的表达与血脑屏障损伤的相关性,并推测其相关发病机制。1

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