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IL17F基因多态性与儿童肠道病毒71型脑炎的相关性研究

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IL17F基因多态性与儿童肠道病毒71型脑炎的相关性研究

lL_17F基因多态性与儿童肠道病毒71型脑炎的相关性研究中文摘要目的研究IL.17F基因多态性与儿童肠道病毒71型脑炎的关系,探讨EV71脑炎的遗传易感性。方法收集2011年7月份2012年6月份手足口病患儿病例。运用RTPCR方法检测患儿大便或脑脊液标本EV71RNA阳性者185例,按临床表现分为单纯HFMD组127例,HFMD并脑炎组58例,提取外周血DNA,用iMLDRTM多重SNP分型技术检测IL.17F7488T/C位点的基因多态性。结果1EV71脑炎组患儿IL.17F7488位点基因型CTCC的分布频率显著低于单纯HFMD组10.3%,27.6%,P0.008,C等位基因分布频率显著低于单纯HFMD组15%,OR0.310,95%CI0.1270.756,PO.006。2EV71感染后IL.17F7488位点TT基因型携带者的CRP、自细胞、中性粒细胞比率较其他基因型携带者显著升高。结论IL.17F参与了EV71脑炎的病理生理过程,IL.17F7488T/C位点TC的基因变异减弱了EV71感染后的炎症反应,降低了EV71脑炎的患病风险,C等位基因是保护基因,而TT基因型、T等位基因是EV71脑炎的遗传易感因素。硕士研究生韩伟平指导教师陈宗波教授关键词肠道病毒71型病毒性脑炎IL17F多态性AssociationofInterleukin一17FGenePolymorphismwithEnterovirus71EncephalitisinPatientswithHand,foot,andMouthDiseaseABSIRAC。IObjectiveToinvestigatetherelationshipbetweenIntedeukin17FGenepolymorphismandthesusceptibilityofenterovirus71infectioninChinesechildren.Methods127CS。SeSofHFMDwithoutencephalitisand58casesofencephalitiswereinvestigatedattheAffiliatedHospitalofQingdaoUniverityMedicalSchoolandChildrenSHospitalofQingdao,China.AllofthemweredetectedEV7linfectionbyreversetranscriptionpolymerasechainrectionRTPCR.UsingthemethodofthetechnologicofiMLDRⅢMultiplexSNPgenotyping.rhenterleukin17F,7488T/Cgenepolymorphismweredetected.Result1ThefrequencyofIL一17F7488TCCCgenotypeswassignificantlyloweramongthepatientswithEv71encephalitis10.3%ascomparedtothatofthepatientswithEV71relatedHFMDwithoutcomplications27.6%,po.008.ThepatientswithEV71enc砷halitishadasignificantlylowerfiequencyoftheIL17F7488Calleles5.2%ascomparedtothatofthepatientswithEV71HFMDwithoutcomplications15%,OR0.310,95%CI0.1270.756,p0.006.2HomozygoteswiththeTallelehadsignificantlyhigherlevelsofCreactiveprotein,whitebloodcellcount,andneutrophilcountastomparedtothepatients、析mCCCTgenotypesp0.004,0.001,and0.000,respectivelyConclusion1ThisstudysuggestedthattheIL一17F7488TICpolymorphismwereinvolvedintheinflammatoryprocessofEV71infection.2TheIL17F7488CallelecouldbesignificantlyassociatedwithprotectionagainstencephalitisinChinesepatientswithEV71relatedHFMD.PostgraduatestudentHanWeipingpeadiatriesDirectedbyProf.ChenZongBoKeywordsEnterovirus71clinicalcharacteristicIntedeukin一18Polymorphism目录jj}l言...1第一章材料与方法21.1材料..21.2方法。4第二章结果92.1一般临床资料92.2IL.17F7488T/C位点多态性分析9第三章讨论12第四章结论14参考文献15综j述................18综述参考文献25攻读学位期间的研究成果29致谢.30学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明31英文缩写Ev7lHFMDEEGMRJCSFILSNP缩略词索引表英文全称enterovirus71hand,footandmousediseaselectroencephalogramMagnaticResonanceImagingeerebrospinalfluidTumorNecrosisFactorSingleNucleotidePolymorphism中文译名肠道病毒7l型手足口病脑电图头颅核磁脑脊液白细胞介素单核苷酸多态性引言引言手足口病是儿童常见传染性病之一,近年来在全球范围内广泛流行【I】。手足口病可由多种病原引起,包括肠道病毒71型enterovirus71,科萨奇病毒coxsackievirusA16、A4、A5、A8、A10、B3、B7A等,其中以肠道病毒71型和科萨奇16最常见12J。大部分手足口病患儿仅表现为发热,手、足、口、臀等部位皮疹或疱疹,病程呈自限性,对症处理后可自愈。但少数EV71感染患儿可并发病毒性脑炎、脑膜炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、神经源性肺水肿等【31,其死亡率与致残率较高。自1997年以来,我国先后有数千例EV71感染引起的死亡病例报道,主要死于脑干脑炎和神经源性肺水肿471。但目前关于EV71引起手足口病或脑炎的发病机制、遗传易感因素等尚未完全明确。EV71感染后机体释放大量炎症因子,这些炎症因子在EV71脑炎的病理生理过程中有举足轻重的作用隅9。在研究EV7l脑干脑炎时,发现淋巴细胞表面的糖蛋白.1CDl62可与肠道病毒71型相互作用诱导大量炎症因子的释放。这些因子不仅介导了机体的固有免疫和获得性免疫发挥抗病毒作用,同时也可对机体的器官和组织造成一定程度的损害【lo】。有研究显示,EV71脑炎组血浆中炎症因子和趋化因子的水平明显高于单纯手足口病组患jI,t11d2J。同时在动物实验中发现n31,EV71感染的老鼠模型持续高水平的炎症因子造成了器官和组织的损害。近来大量研究发现,IL.17和11117细胞参与了EV71感染的病理生理过程【141。IL.17F是IL.17家族中的一种,其也参与EV7l的感染过程【l51。IL.17F能够促进其他炎症因子及趋化因子也.6,CXCLlO的释放,使炎症反应进一步扩大。据报道uoJ,IL.17F7488T/C瑙763780位点的基因TC的改变可导致IL.17F激活促炎细胞因子及趋化因子的能力下降能对抗野生型IL.17F的促炎反应,但对于IL17F,7488T/C位点基因多态性与EV71感染相关性研究尚未见报道。本研究利用iMLDRTM多重SNP分型技术,对185例EV71感染患儿IL.17F7488T/C位点单核苷酸的多态性进行分析,探讨其IL.17F7488T/C位点基因多态性与EV71脑炎患病风险的关系。青岛大学硕士学位论文1.1材料1.1.1研究对象第一章材料和方法2011年7月.2012年6月期间诊断为手足口病的患儿185例,男116例,女73例,年龄2.14.6岁,其中单纯HFMDl27人,HFMD并脑炎58人。其诊断标准符合HFMD控制指南2010版,且经RTPCR逆转录.聚合酶链式反应方法对粪便或脑脊液检测EV71核酸RNA均为阳性。所有患儿收集急性期大便标本入院5天内经处理后保存于.7012冰箱内。同时收集静脉血2ml入院24小时于乙二胺四醋酸EDTA抗凝管中.20℃保存。两组患儿无血缘关系,在年龄和性别上无显著差异。1.1.2主要试剂异硫氰酸胍9一硫基乙醇十二烷肌氨基酸柠檬酸钠无水乙醇异丙醇DEPC血液基因组DNA提取试剂盒普通PCR扩增试剂盒10Xloadingbuffer限制性内切酶NlalllDNAMarker琼脂糖电泳上样缓冲液TAE核酸染料GELVIEW上海生工FlukaAmercoca北京鼎国宝泰克宝泰克宝泰克TIANGEN公司产品TaKaRaTaKaRaNEBTaKaRaPromega宝泰克宝泰克2美国美国美国中国中国中国中国中国日本日本美国日本美国中国中国第一章材料和方法1.1.3主要仪器电子天平Sarroriou公司加样枪Eppendorf公司凝胶图像分析系统PALL公司超净工作台北京西城区半导体设备厂水浴箱东莞市创瑞工业试验设备有限公司PCR扩增仪Eppendorf公司紫外分光光度仪DUR640BECKMAN公司普通冰箱青岛海尔超低温冰箱TOKA高速台式离心机TGL16B超速低温离心机HERAEVS微波炉格兰仕制冰机AFIOScotsmanABl3130XL测序仪赛维亚天津科技发展有限公司1.1.4常用试剂配制美国美国美国中国中国美国美国中国日本中国德国中国英国中国①平衡盐容液1.449Na2HP04,89NaCl,0.29KCl,0.249KH2P04。溶于800mlddU20中,用HCI调pH值至7.4,定容到1L,1.034105Pa灭菌20min。②病毒RNA裂解液终浓度为异硫氰酸胍4M,十二烷基肌氨酸钠0.5%,柠檬酸钠25retool/L,糖原20ug,B.巯基乙醇0.1mmol/L,。③1TAETris碱48.49,硼酸11.42ml,EDTA0.5mol/I20ml,加水稀释成1000ml配成10TAE。50ml10TAE加水稀释至500ml配成l匹溶液。④2%琼脂糖凝胶琼脂糖粉O.49,加入20ml配制的1XTAE微波炉中加热煮沸并摇匀3次,加入2ul核酸染料GELVIEW,摇匀冷却后倒入制胶板中。1.2实验方法1.2.1引物设计根据肠道病毒序列,在肠道病毒5端非编码区设计一对通用引物【忉。根据Ev71病毒VPl基因段设计特异性引物1s19。见表1.1,以上均由由上海天昊遗传分析中心完成。青岛大学硕士学位论文表1.1EV71通用引物和特异引物1.2.2标本的处理1手足口病患儿入院后取血、新鲜大便,合并脑炎患儿经家属同意后行腰椎穿刺术取脑脊液。标本.702保存。2脑脊液可直接用于病毒RNA的提取。3粪便的处理①取49的粪便加16mlHanks平衡盐容液中制成悬液②强烈振荡30min⑧以1000r/min4C离心30min④弃沉淀取上清液,再次50000r/rain离心30mlm⑤弃上清,将沉淀重新悬浮于培养液后再重复④步骤⑥用450rim的微孔滤膜过滤⑦加入青链复合抗生素,使浓度为100U/ml,412过夜⑧将病毒液20u1分装于EP管中,.702冰箱保存。1.2.3病毒RNA的提取采用改良的酸性胍.酚.氯仿一步法AGPC提取病毒RNA。①异丙醇、75%乙醇放入.202冰箱中预冷。②取100ul大便稀液,加入150ul裂解液。充分混匀,室温静止lO分钟,使其充分裂解。③加入250u已预冷的异丙醇,静置5分钟沉淀RNA。④室温下12000r/rain离心10rain。4第一章材料和方法⑤弃去上清,已预冷75%乙醇漂洗一次。⑥室温下12000r/rain离心10rain。⑦真空泵抽戏或室温晾干,沉淀物加入10ul超纯水溶解备用。⑧纯度及含量提取后用紫外线分光光度计测吸光度为260和280的值,计算A260与4280的比值均在约1.8左右,并计算RNA的含量。⑨计算RNA含量,公式260nmOD值稀释倍数40/1000鼢渔含量ug/u1⑩提取的RNA立即逆转录或.70℃冰箱保存。1.2.4病毒RNA的逆转录及PCR扩增1使用Qiagen公司的one.step试剂盒,操作过程按照说明书进行。为保证反应的准确性,每次临床标本检测时均设阳性对照及阴性对照。所有RTPCR扩增阴性及电泳条带较弱的样本,再次取扩增产物作为模板加入引物进行二次PCN宝生物公司的TaKaRa试剂盒,再进行测序或电泳。表1.2RTPCR反应体系50111冰上操作5XBufferQsolution上游Primer6pmol/u1下游Pdmer6pmol/u1EnzymeMixture200pmol/u1dNrPMixture2.5mMeachCSFRNARNAfreewaterlOul10ul5ul5ul2Ill2ullOulUpto50ul表1.3通用引物扩增条件50℃95℃94℃52℃72℃甜e5

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