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MiR34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究

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MiR34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究

硕士学位论文论文题目MiR34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究研究生姓名王娜指导教师姓名柴忆欢教授专业名称儿科学研究方向儿童血液论文提交日期2013年3月MiR34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究中文摘要IMiR34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究中文摘要目的研究miR34b在儿童急性白血病中的表达及其启动子区CpG岛甲基化状态,探讨其临床意义。同时检测miR34b对细胞增殖是否有影响,进一步了解其生物学功能。方法8种白血病细胞株(U937,HL60,MV411,M2R,K562,Raji,CCRF,DAMI),儿童初诊急性白血病(AL)患儿骨髓标本87例,其中初诊急性淋巴细胞性白血病(ALL)患儿55例,初诊急性髓系白血病(AML患儿32例,正常对照患儿43例。提取细胞株或其骨髓标本总RNA,并进行引物特异性逆转录成cDNA,运用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术对miR34b进行检测,循环阈值Ct值比较法进行miRNA表达定量分析。统计分析白血病细胞株、初诊AL、ALL、AML及MLL各组患儿miR34b表达是否有差异,并根据临床资料进行进一步分析,以探讨miR34b在儿童初诊AL、ALL及AML的意义。同时提取细胞株或其骨髓标本DNA,进行重亚硫酸氢钠修饰基因组DNA,运用甲基化特异性PCR(MSP)检测miR34b启动子区CpG岛甲基化状态,并通过甲基转移酶抑制剂(5aza2dC)处理HL60及K562进一步检测其甲基化状态,结合临床资料进一步统计分析儿童初诊AL、ALL及AML与其甲基化状态是否相关。采用脂质体转染hsamiR34bmimics到K562细胞,通过流式细胞仪检测转染效率,CCK8法检测细胞增殖情况。结果1、miR34b在正常对照、白血病细胞株、儿童初诊AL、ALL、AML及MLL各组的相对表达量x±sx分别为5.22±1.15、0.03±0.03、1.18±0.47、1.65±0.69、0.18±0.06、0.64±0.34,与正常对照组相比,儿童初诊ALL组(P0.05)、白血病细胞株组、初诊AL组、AML组及MLL组(P均0.01)均有统计学差异。中文摘要MiR34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究II2、结合临床资料(如性别、年龄、免疫分型、染色体、融合基因、泼尼松实验等)做了进一步分析,发现miR34b的相对表达量与儿童初诊ALL患儿泼尼松实验敏感与否相关(P0.05)。3、miR34b启动子在8种白血病细胞株中均出现甲基化现象,甲基化阳性率为100,本实验共检测50例儿童初诊AL患儿,其中31例初诊ALL患儿,19例初诊AML患儿,其甲基化阳性率分别为64(32/50)、77.42(24/31)和42.11(8/19),同时检测23例正常对照患儿,无一例出现甲基化现象。4、5aza2dC处理白血病细胞株HL60及K562后,miR34b的相对表达量均明显升高,分别为49.5倍和18.8倍,其甲基化条带均明显减弱。5、结合临床资料(如性别、年龄、免疫分型、染色体、融合基因、泼尼松实验等)做了进一步分析,发现miR34b的甲基化状态与儿童初诊AL患儿的免疫分型相关,淋系与髓系的miR34b的甲基化状态之间具有统计学差异(P0.05)。6、脂质体转染hsamiR34bmimics到K562细胞后,流式细胞仪检测转染效率为61,CCK8法检测各组细胞增殖情况,发现转染hsamiR34bmimics组48h、72h、96h及120h均出现细胞增殖抑制作用(P均0.01),其中72h抑制作用最明显,抑制率达45.7。结论1、miR34b在白血病细胞株、儿童初诊AL、ALL、AML及MLL各组患儿中表达均明显减低,提示miR34b可能作为新的抑癌基因参与儿童初诊AL、ALL及AML的形成,同时在MLL基因重排阳性儿童初诊AL的发病中可能起着重要作用,并影响其预后。2、miR34b的相对表达量与儿童初诊ALL患儿泼尼松实验敏感与否相关,提示其是否可以作为判定儿童初诊ALL危险度及预后的指标。3、miR34b启动子在白血病细胞株、儿童初诊AL、ALL及AML中均出现高度甲基化现象,提示miR34b在白血病细胞株、儿童初诊AL、ALL及AML中均受甲基化机制调控,可能作为新的抑癌基因发挥作用。4、5aza2dC处理白血病细胞株HL60及K562后,miR34b的相对表达量明显升高,甲基化条带明显减弱,进一步证实miR34b在白血病细胞株中受甲基化机制调控。5、miR34b的甲基化状态与儿童初诊AL患儿的免疫分型相关,提示miR34b启动子在儿童初诊ALL患儿中甲基化频率高于儿童初诊AML患儿,miR34b在儿童初诊MiR34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究中文摘要IIIALL及AML中可能作为新的抑癌基因发挥作用。6、miR34b对白血病细胞增殖具有抑制作用,提示miR34b在白血病发病中可能发挥抑癌基因作用。关键词白血病,急性,儿童miR34b表达水平CpG岛甲基化临床意义细胞增殖作者王娜指导教师柴忆欢教授英文摘要MiR34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究IVTheexpression、methylatedregulationandclinicalsignificancesofmiR34binpediatricacuteleukemiaAbstractObjectivesToresearchtheexpressionofmiR34bandthemethylationstatusofitspromoterCpGislandsinpediatricacuteleukemia,andexploreitsclinicalsignificances.AlsotodeterminewhethermiR34bhasaninfluenceoncellproliferation,forfurtherunderstandingofitsbiologicalfunction.Methods8leukemiacelllinesU937,HL60,MV411,M2R,K562,Raji,CCRF,DAMI,87casesofnewlydiagnosedpediatricAL,including55ALLcases,32AMLcasesand43casesofcontrol.TotalRNAwasextractedfromthecelllinesorbonemarrowsamples,andthenwhichwastranscribedintocDNAbyspecificprimers.TheexpressionofmiR34bwasdetectedbyTaqmanrealtimefluorescencequantitativepolymerasechainreactionqRTPCRandwasanalyzedwithcomparativemethodincyclethresholdCtvalue.StatisticalanalysiswasusedtotheexpressionsofmiR34binleukemiacelllines,newlydiagnosedpediatricAL,ALL,AMLandMLL,andthencombinedwithclinicaldataforfurtheranalysistoexplorethesignificancesofmiR34binchildrenwithnewlydiagnosedAL,ALLandAML.Atthesametime,DNAwasextractedfromthecelllinesorbonemarrowsamples,andthenwhichwasmodifiedbyweightsodiumbisulfite.ThemethylationstatusofmiR34bpromoterCpGislandsweredetectedwithmethylationspecificpolymerasechainreactionMSP.HL60andK562weretreatedwithmethyltransferaseinhibitor5aza2dCforfurtherdetectionofitsmethylationstatus.CombinedwithclinicaldatatofurtherstatisticallyanalyzetherelationshipbetweennewlydiagnosedpediatricAL,ALL,AMLanditsmethylationstatus.HsamiR34bmimicswastransfectedintoK562cellbyliposome,thetransfectionefficiencywasdetectedbyflowcytometryandthecellproliferationwasmeasuredwithCCK8assay.MiR34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究英文摘要VResults1、Therelativeexpressionlevelsx±sxofmiR34binnormalcontrols,leukemiacelllines,newlydiagnosedpediatricAL,ALL,AMLandMLLwere5.22±1.15、0.03±0.03、1.18±0.47、1.65±0.69、0.18±0.06、0.64±0.34respectively.TheresultsindicatedthatcomparedwithcontrolmiR34bwassignificantlydownregulatedinpediatricALLP0.05,leukemiacelllines,newlydiagnosedpediatricAL,AMLandMLLP0.01.2、Combinedwithclinicaldatasuchasgender,age,immunophenotyp,chromosome,fusiongene,Prednisoneexperiment,etal.todofurtheranalysisfromwhichcouldfindthattheexpressionofmiR34bwassignificantlyrelatedwiththePrednisoneexperimentinpediatricALLP0.05.3、SignificantmethylatedpromoterofmiR34bwasdetectedineightleukemiacelllines,andthepositiveratewas100.ThepromoterofmiR34bwasmethylatedin32of50pediatricAL,including24of31pediatricALLand8of19pediatricAML,themethylatedrateswere64,77.42and42.11respectively.Buttherewasunmethylatedinallof23normalcontrols.4、AfterleukemiacelllinesHL60andK562weretreatedwith5aza2dC,therelativeexpressionlevelsofmiR34bsubstantiallyincreased49.5timesand18.8timesrespectively,andthemethylatedbandsbecameobviouslyweakened.5、Combinedwithclinicaldatasuchasgender,age,immunophenotype,chromosome,fusiongene,Prednisoneexperiment,etal.todofurtheranalysisfromwhichcouldfindthatthemethylationstatusofmiR34bpromoterwassignificantlyrelatedwiththeimmunophenotypeinnewlydiagnosedpediatricALP0.05,andtherewasansignificantdifferencebetweenthelymphoidandmyeloid.6、AfterhsamiR34bmimicswastransfectedintoK562cellbyliposome,itstransfectionefficiencydetectedbyflowcytometrywas61andthecellproliferationwasmeasuredwithCCK8assayfromwhichcouldfindthatthecellproliferationwassignificantlysuppressedat48h,72h,96hand120hinhsamiR34bmimicstransfectedgroupP0.01,themostobviousat72hwiththeinhibitionrateof45.7.Conclusions1、TherelativeexpressionlevelsofmiR34bsignificantlydecreasedinleukemiacelllines,newlydiagnosedpediatricAL,ALL,AMLandMLLgroups,suggestingthat英文摘要MiR34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究VImiR34bmaybeasanoveltumorsuppressorgeneinvolvedintheformationofnewlydiagnosedpediatricAL,ALLandAML,andalsoplayanimportantroleintheMLLgenerearrangementsintheincidenceofnewlydiagnosedALandaffectitsprognosis.2、TherelativeexpressionlevelsofmiR34bwassignificantlyrelatedwiththePrednisoneexperimentinnewlydiagnosedpediatricALL,showingthatwhetheritmaybeanindicatorofriskstratificationandprognosisinpediatricALL.3、ThesignificanthypermethylatedpromoterofmiR34bwasdetectedineightleukemiacelllines,newlydiagnosedpediatricAL,ALLandAML,itrevealsthatmiR34bmayberegulatedwithmethylationmechanisminleukemiacelllines,pediatricAL,ALLandAML,andplayanimportantroleasanewtumorsuppressorgene.4、WithleukemiacelllinesHL60andK562treatedby5aza2dC,therelativeexpressionlevelsofmiR34bmarkedlyincreasedandthemethylatedbandswereobviouslyweakenedwhichfurtherconfirmsthatmiR34bmayberegulatedwithmethylationmechanisminleukemiacelllines.5、ThemethylationstatusofmiR34bpromoterwassignificantlyrelatedwiththeimmunophenotypeinnewlydiagnosedpediatricAL,indicatingthatthefrequencyofmethylationinpediatricALLmaybehigherthanofthatinpediatricAMLandmiR34bmaybeanoveltumorsuppressorgeneinpediatricALLandAML.6、MiR34binhibitedtheproliferationofleukemiacells,implyingthatmiR34bmayplaytheroleoftumorsuppressorgeneinthepathogenesisofleukemia.KeywordsLeukemia,acute,pediatricMiR34bRelativeexpressionlevelsCpGislandsmethylationClinicalsignificanceCellproliferation.WrittenbyWangNaSupervisedbyChaiYihuan目录前言.......................................................................................................1对象和方法...................................................................................................4结果.....................................................................................................18讨论.....................................................................................................30结论.....................................................................................................35参考文献.....................................................................................................36综述.....................................................................................................40英汉双解缩略词..........................................................................................60攻读学位期间公开发表的论文..................................................................62致谢.....................................................................................................63MiR34b在儿童急性白血病中的表达、甲基化调控及临床意义的研究前言1前言白血病是造血系统的恶性肿瘤,是以髓源或淋巴源血前体细胞的异常增生为特征的异质性疾病1。其特征为白血病细胞在骨髓及其它造血组织中无限增生,周围血细胞发生量和质的变化。白血病是儿童发病率最高的恶性肿瘤,发病率为34/100万,并呈上升趋势,我国每年有1万5千左右的新发儿童白血病,其中90以上为急性白血病(AL),慢性白血病仅占35。它的发生发展是一个复杂的、多步骤的过程,随着联合化疗和造血干细胞移植技术的应用,儿童白血病患者的存活率大为改观,但仍有25%~30%的患儿发生骨髓、睾丸或中枢神经系统复发2。对白血病发病机制的进一步研究,有利于寻找新的治疗方法和发现新的预后标志。长期以来,对于白血病分子机制的研究主要着眼于染色体异常以及蛋白质编码基因,近年来发现非编码的microRNA与白血病的发生、发展、临床表现及预后有着密切的关系,在其发生中起促癌或抑癌作用。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约为22nt的内源性单链短序列非编码小RNA,是通过体外进化的选择性扩增机制产生的分子,它们广泛存在于真核细胞中,作为一种重要的调控因子,通过与靶基因mRNA特异性的结合而导致靶mRNA降解或抑制其翻译,在转录后水平调控基因的表达,广泛参与个体发育、细胞分化、增殖、凋亡、衰老、应激等生物学过程35。miRNA基因常聚集在染色体的脆性位点或与癌症相关的基因组区6,与癌基因、抑癌基因一样,miRNA可呈现表达缺失、过表达、基因突变。大量研究表明,miRNA在肿瘤细胞中表达水平异常,与肿瘤的发生、发展及预后密切相关7。目前在人类基因组中已经发现1000多条miRNAs8。计算机预测平均每个miRNA都有潜力调控200多个mRNA,那么总的miRNA可调控人类约1/3的蛋白编码基因,且多个miRNA能够协调活动以调节一些特殊的靶基因9。近来研究表明,miRNA在正常的造血功能中发挥重要的调控作用,可能参与白血病的形成与发展10,11,在白血病的形成中扮演着癌基因或抑癌基因的角色,对判断白血病的预后起着重要作用12。最新研究表明,miRNA的表达受DNA甲基化等表观遗传调控13,且两者可能存

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