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NFκB圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响

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NFκB圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响

硕士学位论文论文题目NFκB圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响研究生姓名黄思红指导教师姓名周云教授专业名称儿科学研究方向泌尿外科论文提交日期2013年3月NFκB圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响中文摘要I苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人郑重声明所提交的学位论文是本人在导师指导下,独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,也不含为获得苏州大学或其他教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明引起的法律责任。学位论文作者签名黄思红日期20130527中文摘要NFκB圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响II学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学有关收集、保存和使用学位论文的规定,即学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文,可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密文件□本论文属于在年月解密后适用本规定。非涉密文件□(请在以上方框内打√)论文作者签名黄思红日期20130527指导老师签名周云日期20130527NFκB圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响中文摘要IIINFκB圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响中文摘要目的本实验研究环状哑铃形圈套寡核苷酸(Circulardumbbelloligodeoxynucleotides,CDODN)转染对核因子κB(NuclearfactorkappaB,NFκB)活性和神经母细胞瘤SKNSH细胞增殖及细胞凋亡的影响,进一步检测凋亡抑制蛋白Survivin的表达情况,探索神经母细胞瘤基因治疗的新靶点。方法电穿孔法将CDODN转染神经母细胞瘤SKNSH细胞系,以未转染基因的SKNSH细胞为空白对照。本实验大致分三个部分1、转染CDODN后NFκB活性的变化免疫激光共聚焦显微镜下观察细胞内NFκB核转位情况变化酶联免疫分析法(Enzymelinkedimmunoassay,ELISA)检测细胞内NFκBp65表达的变化。2、转染CDODN后SKNSH细胞生物活性的变化四甲基偶氮唑蓝比色法methylthiazolyltetrazolium,MTT检测转染CDODN后SKNSH细胞体外增殖活性的变化流式细胞仪技术(Flowcytometry,FCM)检测转染CDODN对SKNSH细胞凋亡的影响。3、NFκB活性抑制后凋亡抑制蛋白Survivin的表达变化蛋白免疫印迹法(Westernblotting)检测NFκB活性抑制后凋亡抑制蛋白Survivin的表达情况,初步研究NFκB与Survivin的关系。每个实验重复三次。采用统计学方法分析实验数据。结果免疫激光共聚焦显微镜观察显示转染CDODN组SKNSH细胞细胞核荧光较空白对照组明显减弱NFκBp65ELISA结果显示转染24、48、72h后转染CDODN组SKNSH细胞吸光度值A明显低于空白对照组(p0.05),表明转染CDODN后SKNSH细胞NFκBp65蛋白表达下降,NFκB活性受到抑制。MTT检测细胞增殖力,结果发现,转染CDODN组细胞MTT曲线幅度更小,以正常SKNSH细胞为对照,转染后24、48、72h的细胞生长抑制率分别为12、29、42(p0.05)流式细胞仪AnnexinV/PI双染色法检测结果发现转染CDODN48h后,转染CDODN中文摘要NFκB圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响IV细胞组和空白对照组的细胞凋亡率分别为(23.01±0.71)和15.84±0.36(p<0.05),转染CDODN后细胞早期凋亡率增加。Westernblotting结果发现与正常对照组比较,转染CDODN组SKNSH细胞凋亡抑制蛋白生存素(Survivin)的表达明显下降。结论CDODN能抑制神经母细胞瘤SKNSH细胞内NFκB活性,抑制肿瘤细胞增殖,诱导神经母细胞瘤肿瘤细胞早期凋亡,并且下调凋亡抑制蛋白Survivin的基因表达。这些实验结果表明,CDODN可能通过阻断NFκB信号传导通路来诱导神经母细胞瘤细胞凋亡,为以NFκB为靶点的神经母细胞瘤基因治疗提供理论依据。关键词核因子κB神经母细胞瘤圈套寡核苷酸生存素作者黄思红指导老师周云教授EffectofnuclearfactorkappaBdecoystrategyonproliferationandapoptosisofneuroblastomacellAbstractVEffectofnuclearfactorkappaBdecoystrategyonproliferationandapoptosisofneuroblastomacellAbstractObjectTostudytheeffectofnuclearfactorkappaBNFκBcirculardumbbelldecoyoligodeoxynucleotidesCDODNtransfectionontheactivationofNFκBandproliferationandapoptosisofhumanneuroblastomacelllineSKNSH,andtoexplorepotentialtargetsforneuroblastomagenetherapy.MethodsCDODNwastransfectedintohumanneuroblastomacelllineSKNSHbyelectrotransformation,andblankSKNSHcellswereusedascontrolgroups.NFκBnucleartranslocationwasstudiedwithlaserconfocalmicrosopy.EnzymelinkedimmunoassayELISAwereusedtodetectNFκBDNAbindingactivity.CellproliferationabilitywasmeasuredbyMTT.Flowcytometry(FCM)wasappliedtoanalyzetheapoptosisofSKNSH.Survivinexpressionwasdetectedbywesternblotting.Alltestswererepeatedforthreetimes.Thedatawereanalyzedbystatistics.ResultsItwasconfirmedbylaserconfocalmicrosopythatthephenomenonofNFκBnucleartranslocationwaslessobviousinSKNSHtransfectedCDODN.EnzymelinkedimmunoassayELISAshowedtheobsorbaneofSKNSHtransfectedCDODNsignificantlydecreased,comparedwiththoseofcontrolgroups,at24th,48th,and72thhours(p0.05).CellproliferationwasdeterminedwithMTTassay,andlowerratesofMTTreductionwasobservedinSKNSHtransfectedCDODNgroupsthancontrolgroups,andthecellgrowthinhibitionratewas12,29and42,respectivelyp0.05at24th,48th,and72thhours.FlowcytometryAnnexinV/PIdoublestainingassayshowedapoptosisratesofSKNSHtransfectedCDODNandcontrolgroupswere23.1±0.71and15.84±0.36p0.05,respectively.EarlyapoptosisratewasincreasedintransfectedCDODNgroups.WesternblottinganalysisshowedthatsurvivinexpressionwasdecreasedinSKNSHcellstreatedwithCDODNcomparedwiththecontrolgroups.AbstractEffectofnuclearfactorkappaBdecoystrategyonproliferationandapoptosisofneuroblastomacellVIConclusionOurresultsshowedNFκBcirculardumbbelldecoyoligodeoxynucleotidesCDODNcanefficientlysuppressDNAbindingactivityofNFκB,inhibitproliferationabilityofhumanneuroblastomacellsandmayinduceapoptosisofhumanneuroblastomacells.TheseexperimentalresultsindicatetheCDODNmayinhibittheoccurrenceanddevelopmentoftumorbyblockingtheNFκBsignalingpathway,whichmaybeprovidetheoreticalbasisfortheneuroblastomagenetherapy.KeywordsnuclearfactorkappaBNFκBneuroblastomadecoyoligodeoxynucleotidesSurvivinWrittenbyHuangSHSupervisedbyProf.ZhouY目录引言.......................................................................................................1材料和方法...................................................................................................3结果.....................................................................................................12讨论.....................................................................................................16结论.....................................................................................................20参考文献.....................................................................................................21综述.....................................................................................................24缩略词汇一览表..........................................................................................37攻读学位期间公开发表的论文..................................................................39致谢.....................................................................................................40NFκB圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响引言1引言神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是儿童最常见的颅外实体性恶性肿瘤,多见于婴幼儿,中位月龄为17月1。根据流行病学统计,NB的年发病率约为0.3/10万5.5/10万2。NB的治疗手段主要是以外科手术结合放、化疗的综合治疗。但该病临床表现多种多样,早期症状不典型,易发生误诊,多数患儿诊断时多已发展为III、IV期,治疗效果及预后均较差,五年生存率<403。外科手术对早期实体瘤的患者较为有效,对晚期或出现远处转移灶的患者则达不到治疗目的,放疗和化疗对晚期患者有一定的效果,但在过去的二十年,通过研究大量放化疗方案,其五年生存率仅维持在30左右4,而且放化疗副作用极大,对患儿生理及心理发育有一定影响。因此,针对神经母细胞瘤的基因靶向治疗成为了近几年来研究热点。基因靶向治疗是指在细胞分子水平上,针对已经明确或可疑的致癌位点瘤细胞内部的蛋白分子或基因片段设计相应的治疗药物,药物进入体内后特异性结合致癌位点,使肿瘤细胞死亡,而肿瘤周围的正常组织细胞不受影响。该方法具有提高疗效、减少毒副作用的优点。核因子κBnuclearfactorkappaB,NFκB是普遍存在于真核细胞中的多基因调控因子5。一般情况下,NFκB是与其抑制性蛋白inhibitorkappaB,IκB结合而呈非活性状态。近年研究表明,NFκB转录因子在控制细胞增殖和凋亡中具有重要作用,NFκB活性的失控与恶性肿瘤的发生密切相关。NFκB的激活是一个复杂的过程,其具体机制尚不明确,但其中有两个步骤是不可或缺的IκB从NFκBIκB复合物上解离降解,暴露NFκB的催化序列NFκB向细胞核内发生转位,与特定的κB序列结合,并发挥相应的生物作用。肿瘤需经历起源、发展、血管新生、入侵和转移等演变过程,而激活后的NFκB可以通过不同的途径参与这些过程,认为有以下几大原因①NFκB调控肿瘤发展、血管新生、转移这些过程相关基因的表达②激活后的NFκB可促进细胞增殖和诱导细胞凋亡③NFκB的活化可使肿瘤对多种化疗药物的耐药性增强。因而,寻找抑制NFκB过度激活的药物,或将成为肿瘤基因靶向治疗研究领域的新热点。十余年前,Morishita等6提出了一种更加合理并且能够有效阻断NFκB信号通

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