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NMDA致痉挛发作后脑损伤差异蛋白质组学研究

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NMDA致痉挛发作后脑损伤差异蛋白质组学研究

军医进修学院博士学位论文分类号R725密级NMDA致痉挛发作后脑损伤差异蛋白质组学研究ThestudyonbraininjuryofNmethylDaspartateinducedinfantilespasmsratmodelbydifferentialproteomicanalysis作者姓名王静学科专业儿科学导师邹丽萍答辩委员会主席论文答辩日期二O一二年六月三日院校地址北京市复兴路28号邮政编码100853军医进修学院博士学位论文军医进修学院博士学位论文军医进修学院研究生学位论文原创性声明秉承我院敬业、勤奋、求实、创新的学风,本人声明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证书而使用过的材料,对本文的研究作出贡献的个人或集体,均已在文中做了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。论文作者签名日期指导教师签名日期军医进修学院研究生学位论文版权使用授权书本人保证毕业离院后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医进修学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文原件、复印件和电子版本,可以采用影印、缩印、扫描或其它手段保存论文以供被查阅和借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)。论文作者签名日期指导教师签名日期军医进修学院博士学位论文军医进修学院博士学位论文目录英文缩略对照词表........................................................1中文摘要................................................................3ABSTRACT................................................................5主要仪器设备............................................................7第一章婴儿痉挛症脑损伤机制及孕期应激因素对发病影响的研究.............9前言................................................................9材料和方法.........................................................12结果.............................................................23讨论.............................................................30小结.............................................................32参考文献...........................................................33第二章ACTH对婴儿痉挛症所致脑损伤保护机制的研究.........................38材料和方法.........................................................39结果.............................................................42讨论.............................................................47小结...............................................................50参考文献...........................................................50第三章差异蛋白生物学功能的初步研究..................................53材料与方法.........................................................53结果............................................................55讨论.............................................................56参考文献...........................................................57综述.................................................................58个人简历...............................................................65致谢..................................................................67军医进修学院博士学位论文军医进修学院博士学位论文1英文缩略对照词表英文缩写英文名称中文名称NMDANmethylDaspartateN甲基D天门冬氨酸2DETwodimensionalgelelectrophoresis双向电泳APSAmmoniumpersulfate过硫酸铵BisN,Nmethylenebisacrylamide甲叉双丙烯酰胺CACarrierampholyte载体两性电解质CHAPS33cholamidopropyldimethylammonio1propanesulfonate3(3胆酰胺丙基)二乙胺丙磺酸DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸FWFormulaweight分子量GAPDHGlyceraldehydes3phosphatedehydrgenase甘油醛3磷酸脱氢酶HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IEFIsoelectricfocusing等电聚焦IPGImmobilizedpHgradient固相pH梯度KDKilodalton千道尔顿ODOpticaldensity光密度PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液pIIsoelectricpoint等电点SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠TBSTrisbufferedsalineTris盐缓冲液TEMEDN,N,N,Ntetramethylethylenediamine四甲基乙二胺TFATriflouroaceticacid三氟乙酸TrisTrishydroxymethyl)aminoethane三羟甲基氨基甲烷VhVoltagehours电压伏小时军医进修学院博士学位论文2军医进修学院博士学位论文3中文摘要作者王静学科专业儿科学导师邹丽萍NMDA致痉挛发作后脑损伤差异蛋白质组学研究目的婴儿痉挛症Infantilespasms,IS是一种特发于婴儿期的年龄依赖性癫痫脑病,临床上以反复痉挛发作、脑电图高度失律、明显的精神运动发育落后为特征。70~90的患儿可伴有重度认知功能障碍,智力倒退等严重脑损伤,病因可多达200余种,临床流行病学提示,母孕期精神应激对子代健康的具有影响,婴儿痉挛症的发病与母亲产前不良应激明显相关。婴儿痉挛症属于难治性癫痫,几乎所有的传统抗癫痫药物均药效欠佳,但促肾上腺皮质激素释放激素(ACTH)对其有独特疗效。因此,本研究通过建立婴儿痉挛症动物模型,利用差异蛋白质组技术,旨在研究探讨婴儿痉挛症的发病机制、孕期应激因素的影响及ACTH对婴儿痉挛的治疗机制。方法利用未成熟脑对N甲基D天门冬氨酸NMDA高度敏感,制备乳鼠痉挛发作模型,差异蛋白质组技术分析以下三类动物模型间的差异(1)痉挛模型组与正常对照组比较,探讨发病机制(2)孕期应激痉挛模型组与痉挛模型组比较,分析孕期应激作用机制(3)ACTH治疗组与非治疗组比较,研究ACTH的治疗机制。将动物模型的脑组织样本进行双向电泳分离,获得双向胶图,依据实验分组,Imagermarster软件分析各组间蛋白表达差异,选取差异蛋白进行胶内酶切,质谱鉴定,生物信息学方法分析并构建差异蛋白相互作用网络,探讨生物功能的调节网络。对部分差异表达蛋白进行westernblot验证。并收集了5例婴儿痉挛症患儿的手术切除的颅内致痫灶样本,通过免疫组织化学的方法初步验证差异蛋白的表达,探讨其生物学功能。结果(1)孕期应激痉挛动物模型组较痉挛动物模型组,痉挛发作的潜伏

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