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S100A8A9在新生大鼠脓毒症中的表达变化及意义

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S100A8A9在新生大鼠脓毒症中的表达变化及意义

硕士学位论文论文题目S100A8/A9在新生大鼠脓毒症中的表达变化及意义研究生姓名高沙沙指导教师姓名俞生林专业名称儿科学研究方向新生儿学论文提交日期2013年3月S100A8/A9在新生大鼠脓毒症中的表达变化及意义中文摘要IS100A8/A9在新生大鼠脓毒症中的表达变化及意义中文摘要目的新生儿对病原微生物高度易感,脓毒症发病率及病死率高。固有免疫是机体抵御病原体感染的第一道防线,固有免疫细胞通过模式识别受体(PRRS)不仅能够识别外源性病原菌相关分子模式PAMPS,而且能够识别内源性损伤相关分子模式(DAMPS),从而启动机体免疫应答;S100A8/A9蛋白分子是由S100A8和S100A9构成的异二聚体,选择性表达于中性粒细胞、单核巨噬细胞等固有免疫细胞,目前发现其在感染性疾病中有着复杂的生物学功能。本课题通过建立新生大鼠脓毒症模型来分析S100A8/A9在肺、肝组织中的表达以及炎症因子TNFⱭ、IL6水平的变化,探讨S100A8/A9在新生大鼠脓毒症发病机制中的作用,从而为脓毒症免疫干预提供新思路。方法采用SPRAGUEDAWLEYSD7日龄大鼠36只腹腔注射脂多糖(LPS)300UG/KG建立脓毒症模型实验组;同样SPRAGUEDAWLEYSD7日龄大鼠36只腹腔注射等量生理盐水建立对照组。两组新生大鼠按照随机原则分别于注射后2、4、8、12、24、48H收集肺脏、肝脏并保存,每个时间点均为6只SD大鼠。用REALTIMEPCR方法检测肺脏和肝脏S100A8、S100A9、TNFⱭ、IL6的MRNA水平,免疫组织化学分析的方法检测肺组织、肝组织S100A8/A9蛋白分子的表达。结果1REALTIMEPCR结果显示,与对照组相比,脓毒症组新生大鼠肝组织和肺组织中S100A8、S100A9、TNFⱭ的MRNA水平均明显升高,且变化趋势类似。S100A8于2小时开始增加P001,至8小时左右达高峰,一直维持较高水平至48小时;S100A9于2小时开始升高P001,12于小时左右达高峰,至48小时有所下降,但仍高于对照组;TNFⱭ于2小时开始升高P001,并逐步增高至12小时,48小时仍维持较高水平;2、REALTIMEPCR结果显示,与对照组相比,脓毒症组肺脏组织IL6于4小时表达明显升高P001,8小时出现高峰,48小时表达仍高于对照组;肝脏组织IL6于4小时表达明显升高P001,12小时出现高峰,48小时表达仍维持较高表达水平。3、免疫组化结果显示,在脓毒症组肝肺组织中S100A8/A9异二聚体2小时表达明显增多P001,24小时左右达高峰,48小时仍维持高表达水平。中文摘要S100A8/A9在新生大鼠脓毒症中的表达变化及意义II结论1、新生大鼠脓毒症发病过程中,随着病情进展,肺、肝组织炎症损伤明显加重,促炎因子TNFⱭ、IL6的表达增加,证明炎症损伤是新生儿脓毒症发病早期的主要特征。2、脓毒症新生大鼠肝、肺组织中表达S100A8/A9,并随疾病进展,呈时间依赖性的升高,提示S100A8/A9参与新生儿脓毒症病理生理学过程。3、脓毒症新生大鼠肝、肺组织中促炎因子TNFⱭ、IL6的表达与S100A8/A9表达呈正相关,提示S100A8/A9可能与炎症因子产生协同作用,共同加剧新生儿脓毒症的脏器损伤。关键词S100A8/A9;TNFⱭ、IL6;脂多糖;新生儿脓毒症作者高沙沙指导教师俞生林THESIGNIFICANCEOFS100A8/A9INNEONATALRATSSEPSISABSTRACTIIITHESIGNIFICANCEOFS100A8/A9INNEONATALRATSSEPSISABSTRACTOBJECTIVENEONATESARESUSCEPTIBLETOBACTERIALINFECTION,WHICHLEADTOHIGHMORBIDITYANDMORTALITYFROMSEPSISTHEINNATEIMMUNESYSTEMREPRESENTSTHEFIRSTLINEOFDEFENSEAGAINSTINVADINGPATHOGENSANDOTHEREXTERNALHARMFULAGENTSTHEPATTERNRECOGNITIONRECEPTORSPRRSOFINNATEIMMUNECELLSNOTJUSTCANRECOGNIZEPATHOGENASSOCIATEDMOLECULARPATTERNSPAMPS,BUTRECOGNIZEDAMAGEASSOCIATEDMOLECULARPATTERNSDAMPSTHEN,IMMUNESYSTEMINITIATESRESPONSESS100A8/A9,AHETERODIMERICCOMPLEXHASBEENIDENTIFIEDASIMPORTANTDAMPSRELEASEDBYACTIVATEDPHAGOCYTESS100A8/A9PLAYSIMPORTANTROLESININFLAMMATIONINTHISSTUDY,WEESTABLISHTHEMODELOFNEONATALRATS’SEPSISTOANALYSETHEVARIATIONOFS100A8/A9HETERODIMERANDCYTOKINETNFⱭ、IL6THEALLISINORDERTOINVESTIGATETHEROLEOFS100A8/A9INTHEPATHOGENESISOFSEPSISOFNEONATALRATS,ANDTRYTODEVELOPANEWIDEAOFIMMUNOMODULATIONANDINTERVENTIONINNEONATALSEPSISMETHODSCHOOSINGRANDOMLY367DAYOLDSPRAGUEDAWLEYSDRATSWITHSPECIALPATHOGENFREESPF,THEANIMALSRECEIVEDANINTRAPERITONEALINJECTIONOFLPSTOESTABLISHTHESEPSISGROUPOTHER36RATSRECEIVEDANINTRAPERITONEALINJECTIONOFTHESAMEAMOUNTOFNSTOESTABLISHTHECONTROLGROUPTHEN,THETWOGROUPSRATSWERERANDOMLYASSIGNEDTODIFFERENTTIMEPOINTS,INCLUDING2,4,8,12,24,48HOURSANDTHEREWERE6NEONATALRATSINEACHTIMEPOINTATEACHTARGETTIMEPOINT,WEGOTTHETHELUNGSANDLIVERSFORANALYSISREALTIMEPCRWASCHOSENTOANALYZETHEMRNAEXPRESSIONOFS100A8、S100A9、TNFⱭANDIL6IMMUNOHISTOCHEMISTRYWASCHOSENTOANALYZETHEEXPRESSIONOFS100A8/A9INTHELUNGSANDLIVERSRESULTS1THERESULTSOFREALTIMEPCRINDICATETHEVARIATIONTRENDOFTHES100A8MRNA、S100A9MRNA、TNFⱭMRNAINTHELUNGSANDLIVERSOFSEPSISGROUPWASBASICALLYSIMILARCOMPAREDTOTHECONTROLGROUP,INTHELUNGSANDLIVERSOFTHESEPSISGROUP,S100A8MRNAPRESENTEDHIGHERLEVELATTHESECONDHOURP001,ANDREACHEDAPEAKABOUT8HOURS,TO48HOURSHASBEENATAHIGHLEVEL;S100A9MRNAPRESENTEDHIGHERABSTRACTTHESIGNIFICANCEOFS100A8/A9INNEONATALRATSSEPSISIVLEVELATTHESECONDHOURP001,ANDREACHEDAPEAKABOUT12HOURS,TO48HOURSOFTHEEXPERIMENTKEPTATHIGHERLEVELTNFⱭMRNAPRESENTEDHIGHERLEVELATTHESECONDHOURP001,ANDREACHEDAPEAKABOUT12HOURS,TO48HOURSKEPTATAHIGHLEVEL;2INTHELUNGSOFSEPSISGROUP,IL6MRNAPRESENTEDHIGHERLEVELATTHEFOURTHHOUR,REACHEDAPEAKABOUT8HOURS,TO48HOURSHASBEENATAHIGHLEVEL;INTHELIVERSOFSEPSISGROUP,IL6MRNAPRESENTEDHIGHERLEVELATTHEFOURTHHOURP001,ANDSTEPPEDUPGRADUALLYTO12HOURS,ANDKEPTATAHIGHLEVELTO48HOURS3THERESULTSOFIMMUNOHISTOCHEMISTRYINDICATETHATS100A8/A9HETERODIMEREXPRESSIONINTHELUNGSANDLIVERSOFTHESEPSISGROUPPRESENTEDHIGHERLEVELATTHESECONDHOURP001,THENSTEPPEDUPGRADUALLYTO24HOURS,ANDKEPTATHIGHERLEVELTO48HOURSCONCLUSION1WITHTHEPROGRESSOFTHEEXPERIMENT,THEDAMAGEOFLUNGSANDLIVERSOFNEONATALSEPSISRATSGOTMOREANDMORESERIOUS,ANDTHEEXPRESSIONLEVELOFCYTOKINETNFⱭ、IL6INCREASED,WHICHINDICATEDINFLAMMATORYDAMAGEWASTHEMAINFEATUREOFNEONATALSEPSISINEARLYPHASE2THEEXPRESSIONLEVELOFS100A8/A9HETERODIMERINTHEINFLAMMATORYRATSINCREASEDWITHTIMEDEPENDENTINTHEPROGRESSOFSEPSIS,INDICATEDS100A8/A9INVOLVEININFLAMMATORYRESPONSEOFNEONATALSEPSIS3THEREWASAPOSITIVECORRELATIONBETWEENTHEEXPRESSIONLEVELOFS100A8/A9HETERODIMERANDCYTOKINETNFⱭ、IL6INTHEINFLAMMATORYRATS,WHICHINDICATEDTHESYNERGIESBETWEENS100A8/A9ANDCYTOKINEINORGANDAMAGEOFNEONATALSEPSISKEYWORDSS100A8/A9;TNFⱭ;IL6;LPS;NEONATALSEPSISWRITTENBYGAOSHASHASUPERVISEDBYYUSHENGLIN目录前言1实验器材和方法3结果10讨论22结论25参考文献26综述28中英文对照缩略词表36攻读学位期间情况说明38致谢39S100A8/A9在新生大鼠脓毒症中的表达变化及意义前言1前言脓毒症是指感染导致的全身炎症反应,并可引起组织器官继发性损伤的临床症候群。新生儿时期免疫系统发育不成熟,对病原菌高度易感,并在感染后较短时间导致严重脓毒症,引起多器官功能衰竭(MODS)、脓毒性休克,死亡率高。新生儿时期脓毒症表现不典型,特别是在感染早期,可能仅出现少吃、少动等非特异性表现,临床早期诊断较困难,感染极易进一步加重,迅速出现弥散性血管内凝血DIC、多功能脏器衰竭、感染性休克等情况。研究表明,在脓毒症早期及时做出诊断并予以干预可以有效降低新生儿脓毒症的死亡率。因此,探索能够反映新生儿感染的特异性指标,并在错综复杂的炎症反应中寻找潜在的干预靶标,是围产医学亟需解决的问题。固有免疫是机体抵御病原体感染的第一道防线,固有免疫细胞通过其模式识别受体PATTERNRECOGNITIONRECEPTORS,PRRS,特异地识别病原微生物的病原相关分子模式PATHOGENASSOCIATEDMOLECULARPATTERNS,PAMPS,从而有效地监测病原微生物的入侵以及诱导机体免疫应答反应12;其中TOLL样受体TOLLLIKERECEPTOR,TLR是目前研究最深入的一种特异的I型跨膜受体及病原模式识别受体,在急性炎症反应、细胞信号转导和细胞凋亡中起重要作用,是连接天然免疫和适应性免疫应答的桥梁3;其中TLR4是哺乳动物脂多糖(LPS)的受体和信号转导分子,在介导LPS的病理生理效应中具有重要作用;TLR4不但能识别外源性的PAMPS如细菌的脂多糖,还可识别内源性物质及其降解产物,如机体应激或是组织损伤时释放的热休克蛋白、透明质酸和硫酸乙酷肝素组成的低聚糖等12,这些物质被称为损伤相关分子模式(DAMAGEASSOCIATEDMOLECULARPATTERNS,DAMPS)。进人血液的内毒素激活机体免疫细胞,诱导过度的固有及适应性免疫反应在脓毒症发病中占有重要地位4。免疫细胞释放大量的炎症分子,引起体内的抗炎因子如IL4、IL10、转化生长因子Β(TGFΒ)等与促炎介质如IL1、IL6及肿瘤坏死因子Α(TNFΑ)等失去平衡5678,打破机体免疫稳态,最终导致各器官的损伤。因此,免疫细胞功能状态及炎症因子间的表达水平直接影响到脓毒症病情进展及预后。前言S100A8/A9在新生大鼠脓毒症中的表达变化及意义21965年MOORE等人从牛脑组织中提取到一种能够溶解于100%硫酸铵溶液的蛋白混合物,称之为S100蛋白9,迄今发现有二十二名S100蛋白家族成员,它们由小分子量蛋白组成,能够和钙离子、锌离子等结合,S100A8和S100A9与S100蛋白其他成员一样,两端分别为氨基末端EF1和羧基末端EF2手型结构,中间为铰链区,两侧为疏水区10。因铰链区和羧基末端的氨基酸序列不同,S100蛋白家族各个成员从而具有不同的生物学活性11。四种S100蛋白家族成员S100A8、S100A9、S100A12、S100A6主要表达在髓系细胞,其中S100A8、S100A9、S100A12被认为与炎性疾病有关12。其中S100A8又称髓细胞相关蛋白8(MRP8),S100A9又称髓细胞相关蛋白14(MRP14),两者在CA2依赖方式下形成S100A8/A9异源二聚体,即钙卫蛋白CALPROTECTIN,而发挥生物学功能。正常生理状态下,S100A8/A9具有严格的表达特异性,无活性,而在炎性状态下,能被激活的单核巨噬细胞分泌131415,并产生相应活性。目前,对S100A8/A9的研究主要集中于自身免疫性疾病、肿瘤、心血管疾病等方面领域,在非感染性炎症如炎性肠病、慢性支气管炎、囊性纤维化等疾病中也发现有较高表达水平;然而,在感染性炎症特别是急性感染方面对S100A8/A9的研究较少;近来有研究表明141516,在炎症的急性期中性粒细胞、巨噬细胞等吞噬细胞在炎症因子刺激下能分泌大量S100A8/A9,作为内源性DAMP参与TLR4信号传导通路17,促进更多炎症因子的释放,从而形成正反馈效应,导致过度炎症反应及炎症损伤。尽管S100A8/A9加剧炎症反应的作用及其分子机制已被证实,但新生儿脓毒症发病早期是否伴随S100A8/A9参与还没有报道,S100A8/A9是否能加剧新生儿感染引起的炎症损伤也不清楚。鉴此,本课题将在既往研究的基础上,通过腹腔注射LPS来构建新生大鼠脓毒症模型,动态观察发病不同时相新生大鼠肺、肝组织S100A8、S100A9、S100A8/A9,以及炎症因子IL6、TNFΑ的表达情况,分析S100A8/A9分子及炎症因子的变化规律;探讨S100A8/A9在新生儿脓毒症中的作用,为新生儿抗感染免疫治疗提供新思路。S100A8/A9在新生大鼠脓毒症中的表达变化及意义实验器材和方法3实验器材和方法一、器材与试剂1主要实验器材超低温冰箱80℃日本SANYO公司恒温水浴箱PLOYTRON匀浆机南京高倍德科技发展有限公司瑞士KINEMATTICA多聚赖氨酸玻片武汉博士德生物工程有限公司移液器EPPENDORF公司BIOMATE3S分光光度计美国赛默飞世尔科技有限公司DK8D型电热恒温水槽DK600A型电热恒温水槽电热手提式压力蒸汽灭菌锅上海一恒科技有限公司上海一恒科技有限公司上海医用核子仪器厂计算机图像分析系统德国LEICA公司冰箱韩国三星公司HERAEUS台式高速冷冻离心机瑞典HERAEUS公司微波炉中国海尔集团YP90暖箱宁波戴维医疗有限公司代谢笼苏州冯氏实验动物器材厂电子分析天平TG328A上海天平仪器厂光学显微镜上海齐跃生物科技有限公司超净工作台BMJⅢ型包埋机BMJⅢ型病理组织包埋冷冻台PHYⅢ型病理组织漂烘仪YL3A型迴转式切片机ROACH480PCR仪苏净集团AIRTECH公司常州中威电子仪器厂常州中威电子仪器厂常州中威电子仪器厂上海仪表厂瑞士罗氏公司2所需主要试剂ECOLILPSSIGMA公司S100A8、S100A9、TNFⱭ、IL6及内参引物上海INVITROGEN生物有限公司大鼠S100A8/A9一抗SANTACRUZBIOTECHNOLOGY

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