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sCTLA4在儿童急性B淋巴细胞白血病血清中的表达及与T淋巴细胞活化的相关性研究

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sCTLA4在儿童急性B淋巴细胞白血病血清中的表达及与T淋巴细胞活化的相关性研究

摘要目的探讨急性B淋巴细胞性白血病患儿血清SCTLA4水平与T淋巴细胞活化的相关性。方法采用ELISA法检测30例初发急性B淋巴细胞白血病患儿治疗前和完全缓解后血清SCTLA一4水平,采用流式细胞术测定患儿外周血T淋巴细胞表面MCTLA4的表达。32名健康儿童作为对照研究,比较治疗前、缓解后与对照组之间SCTLA一4、MCTL卜4水平的差异。结果①初发组血清SCTLA一4浓度为34.2718.39NG/L,明显低于正常对照组193.73105.37NG/L,PO.001,差异有统计学意义;②持续完全缓解6个月后SCTLA一4水平与正常对照无显著差异,PO.05;③不同临床危险度之间血清SCTLA4水平无显著差异;④治疗前ALL患儿外周血CD4、CD8T淋巴细胞MCTLA4表达显著高于正常P0.01⑤ALL患儿在达到完全缓解时外周血CD4、CD8T淋巴细胞MCTLA一4的表达显著低于治疗前P0.01,与正常对照组比较无显著差异P0.05。结论①儿童急性淋巴细胞白血病治疗前血清SCTLA4表达水平降低,推测低水平的血清SCTLA一4是激活CTLA4基因高表达的主要途径,结果使MCTLA4合成增加,更有效的与CD28竞争B7结合位点,导致T细胞不能被充分持续活化,对肿瘤细胞的免疫监视与清除功能降低,可能参与了儿童白血病的发病。②SCTLA一4和MCTLA一4受同一基因调控,共刺激分子CD28/CTLA一4与B7形成竞争性结合,MCTLA4起主导作用,而SCTLA4更多的表达在静息的T淋巴细胞上,因此对抑制和终止活化的T淋巴细胞发挥作用较弱。③儿童急性淋巴细胞白血病治疗完全缓解后血清SCTLA一4及MCTLA一4的表达恢复正常,考虑疾病恢复后机体免疫功能得以重建。提示SCTLA一4及MCTLA一4的异常表达与白血病的发病互为因果,在一定程度上可以影响着疾病的发展与转归。关键词急性淋巴细胞白血病;细胞毒性T淋巴细胞抗原4;SCTLA一4ABSTRACTOBJECTIVETOINVESTIGATETHECORRELATIONSBETWEENTHEEXPRESSIONOFSOLUBLECYTOTOXICTLYMPHOCYTEANTIGEN4SCTLA4MOLECULEINCHILDRENWITHACUTELYMPHOBLASTICLEUKEMIAALLANDTLYMPHOCYTEACTIVATION.METHODSATOTALOF30CHILDRENOFALLAND32HEALTHYCONTROLSWASSELECTED.COLLECTTHESERUMOFCONTROLSANDALLCHILDRENWHOWERENEWLYDIAGNOSEDANDWHOGETCONSISTENTCOMPLETELYRELEASE.SERUMCONCENTRATIONOFSCTLA4WASMEASUREDBYENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAY.MEMBRANECTLA一4WASMEASUREDBYFLOWCYTOMETRYFCM.COMPARE.THELEVELSOFSCTLA4ANDMCTLA4AMONGTHOSENEWLYDIAGNOSED,THOSECOMPLETELYRELEASEANDNORMALCONTROLS.RESULTS芏SERUMCONCENTRATIONOFSCTLA4OFALLWITHINITIALTREATMENTWAS34.2718.39NG/LANDWASSIGNIFICANTLYLOWERTHANTHATOFCONTROLS193.73105.37NG/L,P0.05.②THECONCENTRATIONRECOVEREDTOTHENORMALLEVELWHENTHEALLCHILDRENGOTCOMPLETELYRELEASE.THEDIFFERENCEBETWEENDIFFERENTCLINICALRISKSANDSEXESWASNOTNOTABLE.④THELEVELOFCTLA_4ONCD4TCELLSANDCD8TCELLSOFALLBEFORECHEMOTHERAPYWEREHIGHERTHANTHOSEINNORMALCONTROLSMARKEDLYP0.01.⑤THELEVELOFCTLA一4ONCD4TCELLSANDCD8TCELLSDECREASEDSIGNIFICANTLYINCOMPLETEREMISSIONAFTERCHEMOTHERAPYCOMPAREDWIMTHATBEFORECHEMOTHERAPYP0.011ANDHADNOSTATISTICALSIGNIFICANCEINCOMPLETEREMISSIONAFTERCHEMOTHERAPYCOMPAREDWITHTHATNORMALCONTROLSP0.05.CONCLUSIONQTHESERUMCONCENTRATIONOFSCTLA4OFALLCHILDRENDECREASEDANDTHENWECANSPECULATETHATTHELOWLEVELOFSCTLA4ISTHEMAINWAYTOACTIVATEHIGHEXPRESSIONOFCTLA4GENE.MCTLA一4WASSYNTHESIZEDMORETHANBEFOREANDLEADTOCOMBINEB7AND。ASARESULT,TLYMPHOCYTESCANNOTGETCOMPLETELYACTIVATIONANDTHEBODYCANNOTRECOGNIZETHEABNORMALCELLS.ANDTHISMAYBEAREASONOFALL.②SCTLA4ANDMCTLA4WASREGULATEDBYTHESAMECTLA_4GENE.MCTLA一4WASTHEMAINMOLECULEINTHESYSTEMOFCD28/CTLA4B7WHILESCTLA4WASEXPRESSEDINRESTINGTCELLS.THEFUNCTIONRESTRAINANDSTOPTHETCELLSACTIVATIONOFSCTLA4WASINFERIORTOMCTLA4.③THELEVELSOFSCTLA.4ANDMCTLA4RECOVEREDTONORMAL,ANDIT’SREVEALEDTHATTHEBOAYGETIMMUNOLOGICRECONSTITUFIONAFTERCHEMOTHEMPY.THEDISORDEREXPRESSIONOFSCTLA一4ANDMCTLA4MAYPLAYIMPORTANTROLEINTHEPATHOGENESIS,DEVELOPMENTANDPROGNOSISOFALLANDTHEDISEASEINFLUENCESTHEORGANISMIMMUNITYONTHEOTHERHAND.KEYWORDSACUTELYMPHOBLASTICLEUKEMIA;CYTOTOXICTLYMPHOCYTEANTIGEN4;SCTLA4目录引言..1第1章材料与方法.31.1一般资料31.2主要仪器与试剂31.3实验方法31.3.1应用双抗体夹心法测定标本中SCTLA.4水平.31.3.2应用流式细胞仪技术测定标本中MCTLA4水平51,4统计学处理.5第2章结果.62.1病例组及对照组SCTLA4水平62.2病例组不同性别及临床危险度之间SCTLA4水平62.3ALL治疗前后患,IL,J,B周血MCTLA4的表达.6第3章讨论.8结论。11参考文献12综述.14攻读硕士期问发表的论文.21附录..22致谢...一..23致谢一23学位论文独创性声明..24学位论文知识产权权属声明..24青岛大学硕士学位论文引言儿童白血病是一种起源于造血系统的恶性克隆增殖性疾病,在儿童恶性肿瘤中发病率最高,约占所有恶性肿瘤的35%N1近年来儿童白血病发病率呈逐渐上升趋势乜1,随着分子生物学、遗传学及临床治疗学方面的发展,关于该病的发病机制及病理生理方面取得许多突破性进展,但至今仍未完全明确。目前认为任何肿瘤的发生、发展乃至预后都是一个多阶段、多因素参与的复杂过程,在肿瘤的发生发展过程中,免疫系统起着重要作用,功能正常的免疫系统可以有效的识别和清除突变的恶性肿瘤细胞。疫系统和肿瘤细胞之间的相互作用分为3个阶段D1,即清除、均衡和逃逸。肿瘤发生早期,机体免疫系统识别恶变的细胞并且通过多种途径予以杀伤和清除;但如果机体不能完全清除肿瘤细胞,则免疫系统对恶变细胞实施的免疫选择压力就会使弱免疫原性肿瘤细胞得以存活,从而进入免疫均衡阶段。新的肿瘤细胞变异体不断跨过平衡期的免疫抑制作用不断增殖,形成了临床肿瘤,即肿瘤细胞得以免疫逃逸。免疫逃逸的机制涉及肿瘤细胞自身的改变及机体免疫功能障碍等。其中免疫监视功能的缺陷对肿瘤的发病是不可忽视的因素之一。正常免疫监视功能的行使依赖于淋巴细胞的正常活化,而T细胞的活化需要双重信号系统刺激,T淋巴细胞活化需要双信号系统第一信号是T淋巴细胞受体TCELLRECEPTORTCR识别由抗原提呈细胞ANTIGENPRESENTINGCELISAPC提呈的抗原肽一删C复合物;第二信号则为B7CD28通路构成的协同刺激信号。在免疫反应过程中,第二信号的表达有赖于第一信号的正常传递,若后者传递受阻,免疫反应则无法进行;但若APC仅与TCR/CD3复合物及姗C分子作用而缺少第二信号,就不能有效地激活T淋巴细胞,从而导致克隆无反应状态或程序化细胞死亡PROGRAMMEDCELLDEATHPCD。马肖荣等H1研究发现血液恶性肿瘤细胞MHC分子的表达基本是正常的,说明肿瘤细胞将MHCAG提成给T细胞的功能基本正常,特异性第一信号系统的功能是基本正常的;多数学者认为绝大多数病例存在B71缺陷导致的第二信号缺乏可能是肿瘤细胞逃避宿主免疫监视的机制之一。但是共刺激信号CD28/CTLA一4少有研究。CD28/CTLA一4与APC上的B7B71,B72是起主要作用的协同刺激分子。与CD28分子不同,CTLA4与B7家族分子结合后传递负调节信号,通过介导T细胞凋亡、抑制IL2分泌、控制细胞周期及远端信号模式等陆3途径下调或终止T细胞的应答,抑制T细胞增值、活化。CTLA一4对T细胞增生的这种负性调节作用,在介导自身耐受、防止自身免疫病、防止移植排斥反应及调节机体免疫机能,抗肿瘤、抗感1引言染、抗过敏等功能方面发挥重要作用。大量研究显示胃癌、乳腺癌、结肠癌∞删等恶性肿瘤性疾病外周血T细胞CTLA一4表达较对照组明显升高。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原一4表达于活化的CD4和CD8T细胞、B细胞和APC表面,作为淋巴细胞激活的共刺激信号,CTLA4与CD28分子的功能是相反的。在T淋巴细胞应答开始时,其表达的CD28通过与APC上的B7结合而介导T细胞的活化和克隆扩增;已活化的T淋巴细胞逐渐高表达CTLA一4,与CD28竞争性的与B7结合,通过与B7结合而抑制T细胞的过度扩增,从而阻止了T细胞的进一步活化,使免疫应答维持相对平衡状态。SCTLA一4是由于CTLA一4选择性剪切,使CTLA一4基因缺失第3外显子,表现为SCTLA一4形式。基因剪切的机制目前不完全清楚。研究发现SCTLA4主要由静止的T细胞分泌。可分泌到血清中,其表达量和功能易受到遗传变异的影响,同时是一种免疫调节分子。SCTLA一4可竞争性地与APC表面的相应配体B7结合,拮抗CD28的作用,参与T细胞活化负性调节;另一方面,SCTLA4还可抑制CTLA4/B7的相互作用,从而导致CTLA一4抑制作用减弱P101。但由于SCTLA4表达在非激活的T细胞上,推测SCTLA一4可能主要在免疫反应的早期阶段起作用。本课题采用ELISA法检测初发急性B淋巴细胞白血病患儿治疗前和完全缓解后血清SCTLA一4水平,比较治疗前、缓解后与对照组之间血清SCTLA4水平的差异;并采用流式细胞术测定其外周血T淋巴细胞MCTLA4表达。探讨MCTLA4及SCTLA一4在ALL患儿不同时期的表达变化,了解其在ALL发病中的作用,以了解协同刺激分子在ALL发病中的作用,从而提高对白血病发病机制的认识,为ALL的免疫学治疗在临床上的应用提供理论依据。2青岛大学硕士学位论文1.1一般资料第1章材料与方法青岛市妇女儿童医院及青岛大学医学院附属医院血液儿科2012年3月至2012年9月收治的30名B系急性淋巴细胞白血病ALL患儿作为实验组,男18例,女12例,年龄1’14岁,平均年龄5.603.02岁,标危型21例,高危型9例。所有患儿根据其临床表现,均进行骨髓细胞学、免疫学,分子生物学及细胞遗传学检查,诊断标准及完全缓解标准符合2006年儿童血液学组第三次修订草案N1。。对照组为本院健康体检儿童,男21例,女11例,年龄1.5’14岁,平均年龄6.302.76岁,排除其他肿瘤性疾病、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病,近半年无重大感染性疾病,无糖皮质激素等免疫抑制剂用药史。全部研究对象均无血缘关系。1.2主要仪器与试剂洗板机芬兰THERMO公司酶标仪美国BIORAD550公司流式细胞仪EPICSXL美国COULTER公司微量移液器DRAGONLAB上海大龙医疗设备有限公司低速离心机科大创新股份有限公司旋涡混合器XW80A上海医科大学仪器厂人血清SCTLA一4ELISA试剂盒上海慧颖生物科技有限公司鼠抗人FITCCD4单抗、FITCCD8单抗、PECTLA一4单抗、PCCD3单抗、MOUSEIGG2AFITC单抗、IGGLKPE单抗、IGG2APC单抗均购于美国BIOLEGEND公司磷酸盐缓冲液PHOSPHATEBUFFERSOUTION,PBS上海易利生物科技有限公司淋巴细胞分离液FICOLLHYPAGUE上海恒远生物科技有限公司1.3实验方法1.3.1应用双抗体夹心法测定标本中SCTLA一4水平原理用纯化的人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4CTLA4抗体包被微孔板,3第1章材料与方法制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4CTLA4,再与HRP标记的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4CTLA一4抗体结合,形成抗体一抗原一酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4CTLA4呈正相关。用酶标仪在450NM波长下测定吸光度0D值,通过标准曲线计算样品中人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4CTLA4浓度。具体步骤如下1.标准品的稀释在酶标包被板上设标准品孔12孔,在第一、第二孔中分别加标准品100P1,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50UL,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100P1分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50U1,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50U1弃掉,再各取50U1分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50UL,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50U1分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50U1,混匀后从第七、第八孔中分别取50UL加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50U1,混匀后从第九、第十孔中分别取50U1加到第十一、第十二孔中,混匀后从第十一、第十二孔中各取50U1弃掉。稀释后各孔加样量都为50UL,浓度分别为O.6NG/ML,0.4NG/ML,0.2NG/ML,0.1NG/INL,0.05NG/ML,0.025NG/ML。2.加样分别设空白孔空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液50U1,然后再加待测样品10|LL样品最终稀释度为6倍。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。3.温育用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4.配液将3048T的20倍倍浓缩洗涤液用蒸馏水3048T的20倍倍稀释后备用。5.洗涤小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。6.加酶每孔加入酶标试剂50U1,空白孔除外。7.温育操作同3。8.洗涤操作同5。9.显色每孔先加入显色剂A50U1,再加入显色剂B50|LL,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.10.终止每孔加终止液50P1,终止反应此时蓝色立转黄色。4青岛大学硕士学位论文11.测定以空白空调零,450RIM波长依序测量各孔的吸光度OD值。‘测定应在加终止液后15分钟以内进行。将标准品OD值录入EXCEL表格,制作散点图如下,并得出直线回归方程式如下Y222.66X0.2221,将样本OD值代入公式,计算出样品浓度。1.3.2应用流式细胞仪技术测定标本中MCTLA4水平1.样本采集及处理对治疗前初发且未经任何治疗的患儿、治疗后经VDLD方案治疗达到完全缓解并持续缓解于CAT方案巩固治疗休疗23周后的患儿及健康体检儿童分别于清晨空腹采集外周血肝素抗凝3ML,用等量磷酸盐缓冲液PBS稀释后,采用FICO.11分离液分离淋巴细胞,获得单个细胞层后,用PBS缓冲液洗涤,离心去上清后用PBS缓冲液调细胞浓度为5106个/M1左右。2.细胞染色分别取100UL上述样品放入2支实验管和3支调机器用管。实验管分另0力口入20ULFITCCD4、PECTLA一4、PCCD3;FITCCD8、PECTLA4、PCCD3。对照管分别加入IGG2AFITC、IGGLKPE、IGG2APC;IGG2AFITC、IGG2APC;IGGLKPE、IGG2APC。室温避光反应20MIN后,1500RPMM离心5MIN,弃上清。加入LPBS洗液2ML,重悬混匀。1500RPM离心5MIN,弃上清。加入200UL流式细胞洗液重悬细胞,上机检测。。3.流式细胞仪分析在散点图上用FSCSSC设门确定出淋巴细胞的分布位置,首先选定PE阳性的细胞群作为待分析细胞,再分析此细胞群中CD4与CD8的百分率,从而分别计算出CD4T细胞和CD8T细胞上CTLA4的表达。每份标本分析10000个细胞。1.4统计学处理应用SPSSL7.0软件进行统计学处理,计量资料结果以IS表示,组间比较采用T检验或T’检验,同一病例治疗前后比较采用配对资料T检验,PO.05说明差异有统计学意义。5

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