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TLR2和TLR4表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用

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TLR2和TLR4表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用

硕士专业学位论文论文题目TLR2和TLR4表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用研究生姓名刘华献指导教师姓名汪健教授专业名称儿科学研究方向普外科论文提交日期2013年4月TLR2和TLR4表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用中文摘要ITLR2和TLR4表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用中文摘要目的新生儿对细菌、病毒和真菌等引起的感染高度易感,感染性疾病也是导致新生儿死亡的主要病因之一。单核细胞是固有免疫系统中主要的效应细胞,在识别、抗原呈递以及吞噬清除病原体方面发挥着至关重要的作用。TLRS(TOLLLIKERECEPTORS)是单核细胞上表达的一类主要的模式识别受体,单核细胞依赖TLRS及其下游信号网络参与到抗感染免疫应答中。TLR2和TLR4不但可识别外源的病原体,还可识别内源性物质及降解物(如细菌脂多糖、肽聚糖以及热休克蛋白等),是TLRS中较为重要的两种。因此,我们将以TLR2和TLR4为切入点,研究新生儿单核细胞上TLR2、TLR4的表达情况及其下游信号转导的特点,为免疫治疗新生儿感染提供新思路。方法收集29例新生儿(37周42周)的脐血以及24例健康成人外周血,采用流式细胞术分析单核细胞表面TLR2和TLR4的表达水平;取新生儿脐血及健康成人外周血各50ΜL,分别给予PGN(1ΜG/ML)或LPS(10NG/ML)刺激10MIN,以流式细胞术分析单核细胞中P38以及P65的活化水平;另取新生儿脐血和成人外周血各50ΜL,分别用450ΜL含PGN1ΜG/ML或LPS10NG/ML的RPMI1640培养基刺激4H,收集培养上清,采用CBA法(CYTOMETRICBEADSARRAY)检测其中细胞因子IL1、IL6的表达水平。结果1新生儿单核细胞表面TLR2的平均荧光强度(345014)与成人(386019)相比,未见明显统计学差异(P008);而新生儿单核细胞表面TLR4的平均荧光强度(136007)与成人(189012)相比,差异具有统计学意义(P001。同样,新生儿单核细胞TLR2阳性细胞百分比(8547193)与成人(8586146)相比,亦未见明显统计学差异(P088);新生儿单核细胞表面TLR4阳性细胞百分比(4398200)与成人(5382247)相比,差异具有统计学意义(P001。2PGN(1G/ML)刺激后,新生儿P38活化水平为280032,明显低于成人(572中文摘要TLR2和TLR4表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用II023),差异具有统计学意义(P001);新生儿P65活化水平为110002,与成人(113002)相比,未见明显统计学差异。LPS(10NG/ML)刺激后,新生儿P38活化水平为243014,明显低于成人(382024),差异具有统计学意义(P005);经LPS刺激后,新生儿P65活化水平为125002,明显低于成人156004,差异具有统计学意义(P001)。3PGN(1G/ML)刺激后,新生儿细胞因子IL1的释放水平为243741565PG/ML,较成人组344302653PG/ML)明显降低,差异具有统计学意义(P005);PGN刺激后,新生儿IL6的释放水平为17918234171PG/ML,成人IL6的释放水平为16986626500PG/ML,两者相比,无明显统计学差异(P083)。LPS刺激后,新生儿细胞因子IL1的释放水平为4656223PG/ML,与成人组7324790PG/ML)相比,同样具有显著统计学差异(P005);LPS刺激后,新生儿IL6的释放水平为847513488PG/ML,成人IL6的释放水平为947457064PG/ML,两者相比,未见明显统计学差异(P031)。结论与成人相比,新生儿单核细胞表面TLRS的表达水平较低,而且TLRS下游信号通路发育也不成熟,共同导致TLRS配体不能充分诱导新生儿单核细胞活化,释放细胞因子不足,最终使得单核细胞介导的固有免疫应答不充分,不能及时、有效的发现和杀伤病原体,加重感染病情进展。关键词TLR2;TLR4;新生儿感染;单核细胞作者刘华献指导老师汪健THEROLEOFTLR2/TLR4EXPRESSIONANDSIGNALTRANSDUCTIONINNEONATALINFECTIONCONTROLABSTRACTIIITHEROLEOFTLR2/TLR4EXPRESSIONANDSIGNALTRANSDUCTIONINNEONATALINFECTIONCONTROLABSTRACTOBJECTIVENEWBORNSAREHIGHLYSUSCEPTIBLETOINFECTIONSCAUSEDBYBACTERIA,VIRUSESANDFUNGIINFECTIOUSDISEASESARESTILLTHEMOSTCOMMONDISEASESINCHILDRENSEARLYLIFE,WHICHISALSOTHEMAINCAUSEOFDEATHINCHILDRENMONOCYTES,EXPRESSINGTLRSTOLLLIKERECEPTORSONITSSURFACE,PLAYANIMPORTANTROLEINPATHOGENRECOGNITION,PHAGOCYTOSIS,ANTIGENPRESENTATIONANDCLEARANCETHEACTIVATIONOFTLRSANDITSDOWNSTREAMSIGNALINGNETWORKSPLAYAMAJORROLEINTHEFIRSTLINEOFDEFENSEAGAINSTINFECTIONTLR2ANDTLR4,WHICHARETHEMAJORMEMBERSOFTLRFAMILY,COULDIDENTIFYNOTONLYEXOGENOUSPATHOGENS,BUTALSOENDOGENOUSSUBSTANCESANDDEGRADATIONPRODUCTSSUCHASBACTERIALLIPOPOLYSACCHARIDE,PEPTIDOGLYCAN,ASWELLASHEATSHOCKPROTEIN,ETCTHEREFORE,MONOCYTESFROMNEONATALCORDBLOODWERECOLLECTEDINTHISSTUDY,ANDTHEEXPRESSIONANDSIGNALTRANSDUCTIONOFTLR2/TLR4WEREMEASURED,WHICHWOULDPROVIDEVALUABLECLUESTOCLINICTREATMENTOFNEONATALINFECTIONMETHODSFLOWCYTOMETRYWASADOPTEDTOMEASURETHETLR2ANDTLR4EXPRESSIONLEVELSOFTHEPERIPHERALBLOODSAMPLESFROM29NEONATESAND24HEALTHYADULTS50LBLOODSAMPLEFROMEACHGROUPWASSTIMULATEDWITHEITHERPGN(1G/ML)ORLPS(10NG/ML)FOR10MINAT37℃AFTERSTIMULATION,SIGNALINGPATHWAYSINMONOCYTESWEREINVESTIGATEDUSINGPHOSPHOSPECIFICANTIBODIESDIRECTEDAGAINSTP38ANDP65ANOTHER50LBLOODSAMPLEFROMEACHGROUPWERETREATEDWITH450LRPMI1640CONTAININGPGN(1G/ML)ORLPS(10NG/ML)RESPECTIVELY4HOURSLATER,SUPERNATANTSWEREHARVESTEDANDINVESTIGATEDBYCBAMETHODTODETECTINGTHELEVELSOFIL1ANDIL6RESULTS1THETLR2LEVELSDIDNOTDIFFERBETWEENAGEGROUPSINCONTRAST,TLR4EXPRESSIONWERESUBSTANTIALLYLOWERP001INNEWBORNSTHANINADULTS2AFTERSTIMULATIONWITHLPS,ACTIVATIONOFP38ANDP65WEREIMPAIREDINNEWBORNGROUPP005HOWEVER,WITHTHESTIMULATIONOFPGN,THEACTIVATIONOFP38WASIMPAIREDINNEONATALABSTRACTTHEROLEOFTLR2/TLR4EXPRESSIONANDSIGNALTRANSDUCTIONINNEONATALINFECTIONCONTROLIVGROUPCOMPAREDTOADULTTHEREARENODIFFERENTINTHEACTIVATIONOFP65P0053ACCORDINGLY,THELEVELSOFIL1WERESTRIKINGLOWERINNEWBORNSTHANINADULTSAFTERTHESTIMULATIONWITHTLR2ANDTLR4SPECIFICLIGANDSP005,BUTTHELEVELSOFIL6DIDNOTDIFFERBETWEENAGEGROUPSCONCLUSIONSCOMPAREDWITHADULTS,THEREDUCEDEXPRESSIONOFTLRS,IMPAIREDUNDERLINESIGNALINGTRANSDUCTIONANDCYTOKINESPRODUCTIONINNEWBORNAPPEARSTOBEPARTOFTHEFUNCTIONALIMMATURITYOFTHENEONATALIMMUNESYSTEM,WHICHPREDISPOSENEWBORNSTOBACTERIALINFECTIONKEYWORDSTLR2,TLR4,NEONATALINFECTION,MONOCYTESWRITTENBYLIUHUAXIANSUPERVISEDBYWANGJIAN目录前言1资料与方法4结果8讨论14结论18参考文献19综述21缩略词表30致谢31TLR2和TLR4表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用前言1前言新生儿对细菌、病毒和真菌引起的感染高度易感,如今感染性疾病仍然是儿童早期生活中最常见的疾病,也是最主要的致死原因。据报道,全世界每年约有160万新生儿死于感染1,我国流行病学调查显示2005年43289名住院新生儿中,肺炎占46,败血症占5,颅内感染占082。新生儿对感染易感性的增加,除了母体因素以及产科因素外,最主要的原因是新生儿免疫功能的不成熟。新生儿尚未充分接触子宫外环境的各种病原体,缺乏特异抗原的刺激,而且自身合成特异性抗体的能力不足,导致针对病原体的特异性免疫应答低下。近年来,不断有研究表明,固有免疫系统功能缺陷同样也是造成新生儿易发感染性疾病的重要原因34。固有免疫是机体在长期种系发育与进化过程中逐渐形成的一种免疫防御功能,是机体免疫系统的第一道屏障,这些由物理屏障、生物化学屏障、固有免疫细胞和细胞因子所组成的免疫系统,面对各种不同的感染性因素,能起到迅速、广泛的应答作用。而且,固有免疫的应答反应还是特异性免疫应答的基础,可以进一步激活特异性免疫。因此,对于新生儿固有免疫系统的研究,无疑具有十分重要的临床意义。在固有免疫系统中,参与免疫作用的细胞主要包括上皮细胞、吞噬细胞、NK细胞以及ΓΔT细胞、B1B细胞。其中吞噬细胞不仅可以通过其表面的分子识别病原体,起到吸附、吞噬杀灭病原体的作用,而且能够分泌细胞因子以及其它炎性介质,如TNFΑ,IL1,IL6,IL8,IL12,前列腺素、白三烯等,进一步提高机体对病原体清除的作用,并能促进其它免疫细胞的活化,如B细胞、NK细胞的活化等。此外,吞噬细胞尚能对抗原进行加工呈递,启动特异性免疫应答过程。单核细胞是吞噬细胞系统中十分关键的一类免疫细胞,其在外周血中占白细胞总数的13,而且可进一步移行至全身组织器官,发育成巨噬细胞,在固有免疫系统中发挥着举足轻重的作用。因此研究新生儿单核细胞介导抗感染作用的规律及其分子生物学机制,可以进一步了解新生儿固有免疫系统的特点,为临床诊断、预防和治疗新生儿以及婴幼儿的感染性疾病提供新思路。在人类了解微生物的致病概念以后,一直以来就在寻找体内可以识别病原微生物前言TLR2和TLR4表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用2的特有分子。最初,人们在研究果蝇胚胎背腹侧的发育过程发现一种蛋白,命名为TOLL蛋白5,1996年HOFFMAN及其同事发现TOLL突变的果蝇对真菌高度易感6,从此揭开了TOLL受体在固有免疫中所扮演的重要作用。近年来,随着对TOLL蛋白的研究,人们发现在哺乳动物中也同样存在一类与果蝇TOLL蛋白相似的跨膜蛋白,同时将其命名为TOLL样受体7,之后,多个关于哺乳动物膜蛋白中的TLRS被发现,迄今为止,在人类中发现有10个家族成员8910,小鼠中发现13个家族成员11。TLRS结构为I型跨膜蛋白,分胞外区,跨膜区以及胞内区。胞外区均有1925个富含亮氨酸的重复结构(LEUCINERICHREPEAT,LRR),每个LRR由24~29个氨基酸组成,为Β折叠环Α螺旋的结构,整个LRR结构域形成一个马蹄形的结构,可参与对各种病原体的识别。TLRS的胞内区含有TOLL/IL1受体同源区(TOLL/IL1RECEPTORHOMOLOGOUSREGION,TIR),该区是其信号转导的功能域,能特异性地将刺激信号传递到细胞核,从而调节基因的表达。TLRS的配体按来源可分为外源性和内源性配体。外源性配体主要来自于病原微生物进化过程中的保守成分,如细菌的脂多糖、胞壁酸、肽聚糖以及细菌和病毒的核酸等。内源性配体来自机体合成的内源性物质(如热休克蛋白)或细胞外基质的降解成分等。当细胞外病原体相关分子模式配体(PATHOGENASSOCIATEDMOLECULARPATTERN,PAMP)与TLRS结合后,配体信号经TLRS的跨膜区转导进入胞内,通过胞浆区内的TIR吸引并结合下游的不同分子调节器(MYD88或非MYD88),经过MYD88依赖途径或MYD88非依赖途径,激活下游的信号转导链121314。在MYD88依赖途径中,TLRS与MYD88的结合后,通过招募白介素受体相关激酶(INTERLEUKINRECEPTORASSOCIATEDKINASE,IRAKS,包括IRAK1、IRAK2、IRAK4),使IRAK激活后,再与肿瘤坏死因子受体相关因子(TUMORNECROSISFACTORRECEPTORASSOCIATEDFACTORS,TRAFS)相互作用,再激活IKK(INHIBITOROFNUCLEARFACTORKAPPABKINASE)复合体和MAPK(MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASE)家族两条下游途径,之后再分别活化转录因子NFΚB和AP1(ACTIVATORPROTEINA),激活相关基因的表达。MAPK是真核生物信号传递网络中的重要通路之一,在基因表达调控和细胞功能活动中发挥关键作用,其中P38MAPK信号转导通路与在炎症、细胞生长分化和程序性死亡过程中都起着十分重要的调控作用15。P38在受到各种刺激的作用下被激活发生磷酸化,磷酸化后的P38移入核内,进一步磷酸化下游的蛋白激酶和转录因子1617,启动相关基因的表达。NFΚB作为TLRS信号通路中的另外一个关键转录调节因子,TLR2和TLR4表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用前言3共有5个家族成员,分别CRELNFΚ、BLP50/P105、NFΚB2P52/P100、RELAP65、RELB。正常状态下其与IΚB结合可维持NFΚB的非活化状态,在受到细胞因子、LPS、病毒感染等的刺激下,IΚB激酶活化使IΚB解离,从而NFΚB得到释放并发生核转移,P65发生磷酸化并可与多种基本转录因子相作用调节基因的表达18。P38和P65是TLRS信号通路中的两个关键分子,在TLRS信号通路的活化中起着至关重要的作用。TLRS分布的细胞多达20余种,其中TLR2、TLR4只在髓源性细胞如单核巨噬细胞上表达,而且不同的TLRS识别的模式分子并不完全相同,TLR2和TLR4可分别识别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁成分如肽聚糖(PEPTIDOGLYCAN,PGN)、脂多糖(LIPOPLOYSACCHARIDE,LPS)以及脂磷壁酸(LIPOTEICHOICACID,LTA)等1920。受体活化后,最终可产生炎性细胞因子如IL1,IL6,IL12以及炎性效应因子如NO,这些炎性因子可进一步活化并放大炎症反应,以促进对病原体的有效清除。新生儿往往对大多数病原体高度易感,目前认为这种易感性的原因主要是由于新生儿自身的免疫功能不全,而且一般认为胎龄越小、体重越低的新生儿,其免疫功能越加不成熟。但目前我们对新生儿免疫功能不全的原因还缺乏充分的了解,特别是有关免疫功能不足的分子机制,在此方面还缺少相关的研究。前期曾有报道指出早产儿与足月儿相比,其TLRS的表达水平以及信号转导功能明显较足月儿低21,提示TLRS对外源性刺激反应功能不足可能与早产儿对细菌易感性增加的原因有关。本研究以新生儿和成人为研究对象,通过测定新生儿脐血和成人外周血单核细胞表面TLR2和TLR4的表达情况,并分别以PGN和LPS在体外对全血进行刺激,分析其下游信号水平和细胞因子分泌的情况,以明确在应对不同病原体感染时,新生儿和成人单核细胞免疫应答的差异,以期能更好地了解新生儿固有免疫应答的特点,为临床诊断、预防和治疗新生儿以及婴幼儿的感染性疾病提供新思路。

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